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基質(zhì)膠實驗應(yīng)用——3D培養(yǎng)

來源：翌圣生物科技（上海）股份有限公司 2022年07月20日 17:34

傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)是在單層中生長，細胞是扁平并可以在水平面上自由粘附和擴散，但不支持在垂直方向上擴散，2D表面上培養(yǎng)的細胞具有強烈的頂端-基底極性，這種極性與某些細胞類型相關(guān)，例如上皮細胞；3D細胞培養(yǎng)即三維細胞培養(yǎng)，是指將具有三維結(jié)構(gòu)的不同材料載體與各種細胞在體外共培養(yǎng)，使細胞在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長，形成三維的細胞-載體復(fù)合體，主要用于細胞球、類器官等培養(yǎng)。

圖1.在 ECM 涂層玻璃或塑料表面 (2D) 與典型的 3D ECM 之間區(qū)別[1]

作為疾病驗證模型，相比于傳統(tǒng)2D疾病模型，以3D為基礎(chǔ)培養(yǎng)的類器官在闡明疾病的發(fā)展、穩(wěn)態(tài)性和發(fā)病機理等與體內(nèi)環(huán)境更加接近，在多領(lǐng)域?qū)l(fā)揮重要，諸如細胞治療、藥物研發(fā)、基因工程、免疫研究、組織再生等領(lǐng)域，基質(zhì)膠作為類器官和3D培養(yǎng)的重要載體，在其中發(fā)揮著舉足輕重的作用。

表1.2D和3D培養(yǎng)對比[1]

基質(zhì)膠是從富含胞外基質(zhì)蛋白EHS小鼠腫瘤中提取出的可溶性基底膜制備物，其主要成分由層粘連蛋白，Ⅳ型膠原，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）和巢蛋白等組成，還包含生長因子如TGF-beta、EGF、IGF、FGF、組織纖溶酶原激活物和EHS腫瘤自身含有的其他生長因子。為組織和細胞提供支撐、抗拉強度和支架支撐，也可以作為細胞粘附和運動的三維亞結(jié)構(gòu)以及生長因子、趨化因子和細胞因子的儲存庫，同時可作為細胞形態(tài)發(fā)生和分化的信號等。翌圣生物開發(fā)生產(chǎn)的CeturegelTM基質(zhì)膠不含LDEV（乳酸脫氫酶增高病毒），超低內(nèi)毒素含量，并全部經(jīng)過支原體檢測保證無支原體污染，包括基本濃度、高濃度、低生長因子等不同類型基質(zhì)膠。

應(yīng)用方向

產(chǎn)品特點

安全性高：不含LDEV（乳酸脫氫酶增高病毒）

濃度多樣性：濃度范圍在8~20 mg/mL之間

批次穩(wěn)定性好：嚴格生產(chǎn)質(zhì)檢過程保證批次間性能穩(wěn)定

低內(nèi)毒素：內(nèi)毒素含量≤4 EU/mL

污染物檢測：經(jīng)檢測無支原體和細菌、真菌殘留

單批產(chǎn)量高：單批產(chǎn)量在L級別以上

兼容性好：可與任何類型的細胞培養(yǎng)基兼容

3D培養(yǎng)驗證

制備細胞懸液

將24孔細胞培養(yǎng)板、移液槍頭置于冰上預(yù)冷，基質(zhì)膠置于冰上或4℃緩融，取對數(shù)生長期HepG2細胞，使用PBS輕柔潤洗并用胰蛋白酶消化細胞。終止消化后制備并收集單細胞懸液，1500 rpm離心3min，棄上清并用DMEM*培養(yǎng)基重懸細胞，血球計數(shù)板計數(shù)細胞后，用調(diào)整細胞濃度為1.5×105個細胞/mL。

細胞接種

取緩融后的基質(zhì)膠和調(diào)整好濃度的單細胞懸液1:1冰上輕輕混勻，用預(yù)冷的200μL移液槍頭取40~50μL上述混勻單細胞懸液垂直滴于預(yù)冷24孔板中，使其形成拱型細胞液滴。

結(jié)果統(tǒng)計

于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)穩(wěn)定30min后，每孔加入1~2mL DMEM*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察并拍照記錄。

圖2.細胞3D培養(yǎng)4d后結(jié)果

FAQ

01 拿到的基質(zhì)有色差的變化（淡黃色到深紅色）是什么原因？

對于含酚紅的基質(zhì)膠主要原因是由于酚紅和碳酸氫鹽與CO2作用引起的，但是與5％CO2平衡后色差即會減少。凍融后，輕輕搖晃試劑瓶使基質(zhì)膠分散均勻。

02 基質(zhì)膠的操作要注意哪些事項？

所有操作需在無菌環(huán)境下進行，應(yīng)使用預(yù)冷的移液器以保證基質(zhì)膠呈勻漿狀。

03 基質(zhì)膠的如何分裝凍存使用？

可將凍融后的CeturegelTM基質(zhì)膠分裝在多個小管，所有分裝均需用預(yù)冷的凍存管，迅速冷凍并保存，避免多次凍融。所有涉及到使用的物品在使用前需預(yù)冷，使用預(yù)冷的移液管、吸頭及小管等操作基質(zhì)膠。

[1] Baker BM, Chen CS. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 2012 Jul 1;125(Pt 13):3015-24. doi: 10.1242/jcs.079509. Epub 2012 Jul 13. PMID: 22797912; PMCID: PMC3434846.

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