最近經(jīng)常聽到單細(xì)胞ChIP技術(shù)，小翌立馬查閱資料去一探究竟，結(jié)果發(fā)現(xiàn)還是換湯不換藥，這個單細(xì)胞ChIP技術(shù)不就是咱們scCUT&Tag么？

為了幫助大家提升CUT&Tag實(shí)驗(yàn)技能，小翌整理了之前的一些CUT&Tag知識，同時將CUT&Tag實(shí)驗(yàn)的甲醛交聯(lián)方案和CUT&Tag-qPCR方案一起匯總，希望大家進(jìn)一步提升CUT&Tag技能，后續(xù)如果也想嘗試單細(xì)胞ChIP，或者是已經(jīng)在做單細(xì)胞ChIP，咱們也能更得心應(yīng)手。

【注】

A：在CUT&Tag實(shí)驗(yàn)開始前，我們需要確定實(shí)驗(yàn)方案。隨著CUT&Tag技術(shù)的發(fā)展,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)有些目標(biāo)蛋白質(zhì)在研究時，輕微甲醛交聯(lián)效果更好。之后，更多的研究表明，使用CUT&Tag技術(shù)研究不同蛋白時，所需的實(shí)驗(yàn)條件也不一樣。做組蛋白修飾、強(qiáng)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子(如CTCF、RNA polll等)無需甲醛交聯(lián)。而一些弱結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄輔因子則需要甲醛交聯(lián)，并且甲醛交聯(lián)的強(qiáng)度也不一樣。常規(guī)的輕微甲醛交聯(lián)條件為0.1%甲醛室溫交聯(lián)2 min，之后用0.1 M甘氨酸終止交聯(lián)。

B：若在實(shí)驗(yàn)時，有添加甲醛進(jìn)行輕微交聯(lián)，那么后續(xù)加終止buffer后，步驟稍微有調(diào)整哦！甲醛交聯(lián)后，蛋白酶K消化步驟調(diào)整為：向每個樣品中加入2 μL 15× Terminate Solution、1 μL DNA Spike-in mix和1 μL 30× Proteinase K（此時磁珠會板結(jié)）（若樣品較多，可一起提前配制）。全速渦旋樣品約10 sec，混勻后瞬離，將樣品置于PCR儀，55 oC消化2 h (熱蓋不低于70 oC)或者37 oC過夜。

【注】

快速程序適用于絕大多數(shù)基因，個別復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)基因可嘗試標(biāo)準(zhǔn)程序。

a) 退火溫度和時間：請根據(jù)引物和目的基因的長度進(jìn)行調(diào)整。

b) 熒光信號采集（★）：請按照儀器使用說明書要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)程序設(shè)置，幾種常見儀器的時間設(shè)定如下：

20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast

31 sec：Applied Biosystems 7300

32 sec：Applied Biosystems 7500

c) 熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認(rèn)程序。

圖:使用試劑盒中的spikein 3進(jìn)行normalization處理，同一基因在不同投入量細(xì)胞結(jié)果中,基因的富集倍率差異不大。