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護航全流程!宿主核酸殘留去除與檢測完整方案

來源:翌圣生物科技(上海)股份有限公司   2023年08月15日 10:45  

護航全流程!宿主核酸殘留去除與檢測完整方案

 

· 背景介紹 ·

近年來,生物制品已應用到生物醫(yī)藥、生物農(nóng)業(yè)、生物能源、生物制造、生物環(huán)保等多種領(lǐng)域。隨著生物制品的市場占比越來越大,針對生物制品,國家和相關(guān)部門也建立起規(guī)范的質(zhì)量管理體系和標準,其中宿主細胞核酸殘留問題是備受關(guān)注的焦點之一。

 

生物制品如重組蛋白藥、抗體藥、疫苗、細胞與基因藥物等產(chǎn)品是用連續(xù)傳代的菌種株/細胞株表達的,因而產(chǎn)品內(nèi)可能會殘存宿主核酸。殘留的宿主細胞核酸可能引發(fā)細胞因增殖失控變?yōu)槟[瘤細胞,也有可能存在感染性病毒基因從而加劇體內(nèi)免疫反應。為了規(guī)避上述不良后果,從生物制品安全角度和科研需求的層面,進行有效的核酸殘留去除與嚴格的殘留檢測是非常重要的。

 

我國參照WHO、FDA和歐盟的標準,在藥典中明確規(guī)定酵母、大腸桿菌表達的生物制品中的DNA殘留量不超過10ng/劑,CHO和Vero細胞表達的EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗等不超過100或10pg/劑。

 

 

 

01
宿主核酸殘留的去除
 

 

 
1.1 主流去除方法的比較
 
 

在核酸殘留去除工作中,由于DNA帶有大量的電荷與其他生物大分子結(jié)合從而產(chǎn)生聚集(吸附)、包裹作用而難以除去。傳統(tǒng)的方法均存在核酸殘留去除不凈、工作量大、耗時長等缺陷,全能核酸酶則可解決此類難點。

 

 

 
1.2 翌圣方案
 
 

全能核酸酶,又稱非限制性核酸內(nèi)切酶,是一種來源于Serratia Marcescen的非特異性核酸內(nèi)切酶。無論是實驗研究,還是工業(yè)生產(chǎn),全能核酸酶都是目前能夠同時有效去除DNA和RNA的酶。翌圣生物UCF.ME®核酸酶在GMP條件下生產(chǎn),可高效去除各種樣品中的核酸雜質(zhì),廣泛應用于生物醫(yī)學的各個領(lǐng)域。

 

翌圣生物UCF.ME®核酸酶可降解無論是單鏈、雙鏈、線性、圓形還是超螺旋形式的DNA及RNA,無堿基偏好性。UCF.ME®核酸酶具有的核酸酶活性以及的耐受性,可適用于多種操作環(huán)境,能夠在非常廣泛的條件下(6 M Urea,0.1 M Guanidine HCl,0.4% Triton X-100,0.1% SDS,1 mM EDTA,1 mM PMSF),短時間內(nèi)就使樣品中所有的游離核酸降解成長度為2-5個堿基的長度的5'-單磷酸寡核苷酸。后續(xù)也可以通過相應的方法去除UCF.ME®核酸酶,不影響后續(xù)實驗。

 

 
1.3 產(chǎn)品特性
 
 

 

可以降解所有形式的DNA和RNA;

核酸酶活性,樣品中的核酸殘留經(jīng)過短時間處理就能降低到皮克級別;

穩(wěn)定性高,耐受性強,適應各種操作條件;

無動物源性、無抗生素;

GMP條件生產(chǎn),滿足從研發(fā)到生產(chǎn)的大規(guī)模使用需求;

審計資料齊全,產(chǎn)品申報無憂。

 

 
1.4 性能測試——不同反應條件降解DNA的效率檢測
 
 

為了測試產(chǎn)品的使用性能,我們分別測試了2種溫度條件宿主DNA殘留(GAPDH/Actin)和質(zhì)粒DNA殘留情況(Bla),結(jié)果顯示Yeasen UltraNuclease降解DNA的效率與M公司相當(注:測試樣本為:HEK293+慢病毒質(zhì)粒)

 

 

 
1.5 使用條件——有效條件與最佳使用條件
 
 

針對UltraNuclease,我們還進行了使用條件的測試。測試結(jié)果如下表。隨著核酸酶使用濃度的升高,所需處理時間成倍性縮短。針對Mg2+濃度、pH、溫度、DTT、巰基乙醇、單價陽離子、磷酸根離子等的最適濃度條件和有效條件我們均作了嚴謹?shù)臏y試。UltraNuclease的耐受性強。

 

 

 
1.6 穩(wěn)定性測試1——不同因素對酶活的影響
 
 

考慮到不同生產(chǎn)或研究過程中涉及眾多的因素有可能會影響UltraNuclease的穩(wěn)定性,我們測定了9大常見因素對酶活的影響。在實際的研究中可以根據(jù)自身反應工藝結(jié)合我們的測試數(shù)據(jù)做更加適合的體系優(yōu)化,更大限度的滿足各類特殊需求。

 

 

 
1.7 穩(wěn)定性測試2——儲存溫度&反復凍融&運輸
 
 

酶類產(chǎn)品通常需要非常嚴格的運輸條件、儲存條件和凍融次數(shù)限制。我們測試了不同溫度條件下該酶的酶活變化情況、反復凍融次數(shù)對酶活的影響以及干冰運輸對酶活的影響。結(jié)果顯示,-20℃條件下酶活8周均穩(wěn)定;4℃條件下4周內(nèi)酶活僅降低20%;37℃條件下酶活可穩(wěn)定2周。另外再-80至25℃之間凍融10次該酶也表現(xiàn)出較好的酶活特性;冰袋+干冰運輸酶活不受影響。

 

 

 

 
1.8 質(zhì)量保證
 
 
  • FDA備案

  • 生產(chǎn)流程嚴格參照ISO9001/GMP的標準,符合GMP生產(chǎn)標準

  • 符合藥物IND申報要求

  • 無動物源性、無抗生素:使用植物源性和化學合成原料發(fā)酵生產(chǎn),發(fā)酵過程中不添加抗生素

 

 

 

02
宿主核酸殘留的檢測
 

 

全能核酸酶去除樣本核酸殘留后不免有引入全能核酸酶的影響,針對上述情況,Yeasen也提供了相應的檢測方案——UCF.ME® UltraNuclease Elisa Kit。該試劑盒應用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(夾心ELISA)原理檢測變性與非變性的UCF.ME® Ultra Nuclease全能核酸酶的殘留,用抗UCF.ME®Ultra Nuclease的兔多克隆抗體包被微孔板,形成固相抗體,向固相抗體微孔板中加入UCF.ME®Ultra Nuclease標準品和待測樣品,然后加入生物素(Biotin)標記的Anti-Ultra Nuclease多抗,最后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(SA-HRP),形成抗體+ 抗原+抗體-Biotin+SA-HRP復合物,經(jīng)過洗滌后加入TMB底物顯色;TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)換成黃色,顏色的深淺與樣品中UCF.ME®Ultra Nuclease的量呈正相關(guān)。本試劑盒檢測定量范圍0.047-3 ng/mL;檢測下限:23.5 pg/mL。

 


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