CRISPR技術(shù)自2012年問(wèn)世至今，憑借其的性能，迅速在基因編輯領(lǐng)域嶄露頭角，成為了基因編輯工具。這一技術(shù)的誕生，為基因功能研究、藥物靶點(diǎn)篩選、遺傳疾病治療、癌癥研究以及作物育種等多個(gè)領(lǐng)域帶來(lái)了突破性的進(jìn)展。因其顯著的成果，科學(xué)家Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna榮獲了2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

圖1. 2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主[1]

CRISPR/Cas系統(tǒng)的核心依賴于兩個(gè)主要組件：一是具有核酸切割能力的Cas蛋白；二是特異性指導(dǎo)Cas蛋白精確剪切的向?qū)NA（gRNA）。因此，在基因編輯過(guò)程中，除了選擇合適的高效Cas蛋白外，精心構(gòu)建高效且具有針對(duì)性的sgRNA同樣至關(guān)重要。gRNA由一個(gè)tracrRNA和至少一個(gè)crRNA組合構(gòu)成，Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna通過(guò)將tracrRNA和crRNA融合成一條單鏈——單鏈向?qū)NA（sgRNA），極大地簡(jiǎn)化了sgRNA的生成和應(yīng)用步驟。通常所說(shuō)的sgRNA設(shè)計(jì)實(shí)際上是指對(duì)其中的crRNA組成部分進(jìn)行精確設(shè)計(jì)，以便挑選出適合的sgRNA。

圖2. sgRNA示意圖（以Cas9為例）

sgRNA的合成方法主要分為體外轉(zhuǎn)錄（IVT）和化學(xué)合成兩種，其中，由于IVT方法具備操作靈活、成本效益高以及產(chǎn)出量大等優(yōu)勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中被廣泛采用。

經(jīng)過(guò)精心的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)，翌圣生物推出了專門(mén)針對(duì)Cas9蛋白的sgRNA體外轉(zhuǎn)錄合成試劑盒——Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit（11355ES）。該試劑盒的應(yīng)用極為簡(jiǎn)便，用戶只需設(shè)計(jì)一條特定的上游引物，并結(jié)合試劑盒提供的其他試劑，即可在短短4h內(nèi)合成20-100 μg高品質(zhì)的sgRNA。所產(chǎn)生的sgRNA具備高產(chǎn)量、高純度和高活性等優(yōu)勢(shì)，在基因編輯過(guò)程中能顯著提升編輯效率，并大幅降低脫靶現(xiàn)象的發(fā)生幾率，確?；蚓庉嫻ぷ饕愿咝屎透邷?zhǔn)確性進(jìn)行。

sgRNA的濃度關(guān)系到CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效果成敗，只有加入高濃度的sgRNA方能對(duì)基因的編輯起較好效果。翌圣的Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit可在單管反應(yīng)4h內(nèi)獲得20-100 μg的sgRNA，足以滿足基因編輯的需要。

圖3. 不同時(shí)間的sgRNA的合成量

一個(gè)優(yōu)質(zhì)的sgRNA Synthesis Kit不僅應(yīng)具備高產(chǎn)量sgRNA的合成能力，還應(yīng)兼容各種類型的sgRNA合成，以滿足不同基因編輯的需求，從而拓寬產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。使用翌圣生物的Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit同時(shí)合成10種不同序列的sgRNA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該試劑盒能夠高效合成不同序列的sgRNA，在使用過(guò)程中無(wú)需考慮序列差異的影響。

圖4. 不同序列的sgRNA的合成產(chǎn)量

除了sgRNA的產(chǎn)量，合成的sgRNA的純度也是影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯的效果的關(guān)鍵因素之一。如果合成的sgRNA的純度差，易出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。翌圣Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit合成的sgRNA經(jīng)過(guò)安捷倫2100測(cè)定，其條帶明顯且無(wú)雜帶，說(shuō)明sgRNA純度高。

圖5. 合成的sgRNA的純度（安捷倫2100測(cè)定）

使用翌圣Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit合成的sgRNA與Cas9組合用于體外切割靶DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所合成的sgRNA可以有效引導(dǎo)Cas9在特定位點(diǎn)切割并產(chǎn)生特定大小的DNA片段。

圖6. sgRNA的剪切效率效果圖

翌圣生物一直深耕基因編輯領(lǐng)域，并推出了一系列高品質(zhì)的原料，旨在為基因編輯技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步提供支持。除了Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit外，翌圣生物可提供基因編輯相關(guān)蛋白，如Cas9、Cas12a和Cas12b等相關(guān)產(chǎn)品。