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如火如荼的單細胞技術目前被大家廣為接受，而且單細胞技術除了在科研研究領域遍地開花，也廣泛應用于抗體發(fā)現(xiàn)、藥物評價、用藥靶向指導等領域。
現(xiàn)階段，單細胞測序方法普遍需要依賴于微孔板裝置、微流體裝置或流體處理。而且微流控、微孔板等裝置價格不菲，成為單細胞技術研究的一大壁壘。
2023年3月6日，Nature Biotechnology上發(fā)表了一篇關于PIP-seq（Particle-templated instant partition sequencing ）的文章——Clark IC, Fontanez KM, Meltzer RH, et al. Microfluidics-free single-cell genomics with templated emulsification. Nat Biotechnol. 2023;41(11):1557-1566. doi:10.1038/s41587-023-01685-z。PIP-seq是一種不需要專門的微流體設備、專業(yè)知識或硬件的方法。它基于粒子模板乳化，允許人們僅使用渦旋器在均勻的液滴乳液中對 cDNA 進行單細胞封裝和條形碼。粒子模板即時分區(qū)測序 (PIP-seq) 適用于多種乳化形式，包括微孔板和大容量錐形管，可在幾分鐘內(nèi)處理數(shù)千個樣品或數(shù)百萬個細胞。
圖.PIP-seq單細胞實驗流程圖
a、乳化過程示意圖。條形碼顆粒模板，細胞和裂解試劑與油和渦流相結合，以產(chǎn)生單分散的液滴。
b、細胞裂解釋放mRNA，mRNA與偶聯(lián)了條形碼以及oligod(T)的beads結合。
c、除油后將mRNA逆轉錄成cDNA。利用TSO進行后續(xù)的鏈置換步驟。
d、全長cDNA獲取，cDNA含有條形碼以及Illumina測序所需序列。
讓我們來看看作者發(fā)表的文獻中PIP-seq的數(shù)據(jù)表現(xiàn)情況吧。
使用人和鼠的混合樣本進行PIP-seq實驗，總細胞捕獲數(shù)為1595個，其中雙胞細胞數(shù)為12個，雙胞率為0.75%
圖.雙胞率檢測結果圖
使用健康的乳腺樣本同時用PIP-seq和10x Genomics V3版本試劑進行實驗，結果顯示PIP-seq能區(qū)分管腔上皮細胞(LEP1和LEP2)、肌上皮細胞、成纖維細胞、血管細胞和免疫細胞的兩個譜系。將10x的數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)抽取，使其捕獲細胞數(shù)降至2400個，每個細胞的測序量維持在36500reads。最終對比顯示，PIP VS 10x Genomics結果為，unique gene數(shù)為2298 vs 1757，轉錄本數(shù)對比7491 vs 3394，線粒體占比2.34% vs 1.32%。PIP-seq與10x Genomics結果進行marker基因分析，結果顯示marker基因分析結果一致。
圖：使用PIP-seq精確地分析健康乳腺組織的單細胞轉錄譜（PIP-seq及10x Genomics結果對比）
PIP-seq用于CRISPR篩選
使用PIP-seq進行CROP-seq實驗，結果顯示PIP-seq能夠用于CRISPR篩選。
圖.使用PIP-seq進行轉錄組和gRNA測序
MPAL復發(fā)的轉錄組學特征
圖.細胞系和人類樣本中耐藥癌癥表型的分子特征
結 論
該文章作者證明PIP-seq在小鼠-人混合研究中產(chǎn)生高純度的轉錄組，與多組學測量相兼容，與商業(yè)微流體平臺相比，可以準確表征人類乳腺組織中的細胞類型。使用PIP-seq對混合表型急性白血病的單細胞轉錄譜分析揭示了標準免疫表型所隱藏的化療耐藥細胞亞群內(nèi)異質(zhì)性的出現(xiàn)。PIP-seq是一種簡單，靈活和可擴展的下一代工作流程，可將單細胞測序擴展到新的應用。
對于能不使用特定設備就能完成的單細胞實驗，肯定是會好評，但是PIP-seq仍然需要有更多的應用才能被市場接受。那有沒有其他技術是廣被市場認可的呢？Smart-seq2當仁不讓可稱之為被市場認可的無需特定昂貴設備就能完成的單細胞實驗（ps：前期需要通過單細胞分選）。Smart-seq2能得到單細胞全長轉錄組序列，單個細胞的基因檢出數(shù)是目前單細胞技術中最高的（可參考Smart-seq2：單個細胞以及微量細胞轉錄組建庫成功的保障）。
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