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生物素—親合素系統(tǒng)

來源:上海希美化學(xué)有限公司   2010年03月31日 13:40  

生物素-親合素系統(tǒng)(Biotin-Avidin—System,BAS)是70年代末發(fā)展起來的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。隨著各種生物素衍生物的問世,BAS很快被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。1979Guesdon利用生物素和親合素間具有高度親合力的特點,建立了標記親合素和生物素法(LABBA)與橋聯(lián)親合素生物素技術(shù)(BRAB)。1981Hsu報告了改進的親合素生物素過氧化酶復(fù)合物法(ABC法)。近年大量研究證實,生物素親合素系統(tǒng)幾乎可與目前研究成功的各種標記物結(jié)合,如酶、熒光素、同位素、凝集素、鐵蛋白、SPA等。生物素親合素與標記試劑高親合力的牢固結(jié)合及多級放大效應(yīng),使BAS免疫標記和有關(guān)示蹤分析更加靈敏。BAS已成為目前廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術(shù)。

生物素又稱維生素H,多從含量較高的卵黃(α型)及肝組織(β型)中提取,亦可人工合成。生物素分子量為244.31,分子式為 C10H16O3N2S,pI3.5,是羧基轉(zhuǎn)化酶作用的一種輔酶,故又稱輔酶R,具有α、β兩型,其生物活性基本相同。生物素環(huán)形結(jié)構(gòu)中的I環(huán)為咪唑酮環(huán)(又稱Ureido環(huán))(I環(huán),是與親合素結(jié)合的主要部位;生物素的環(huán)結(jié)構(gòu)為噻吩環(huán),帶有一個戊酸側(cè)鏈,末端羧基是標記抗體和酶的*結(jié)構(gòu)??贵w分子經(jīng)生物素化后,其結(jié)合抗原的活性不受影響。多種酶結(jié)生物素化后,其催化力保持不變或稍有降低。因此生物素可與多種標記物結(jié)合,適用于多種免疫檢測技術(shù)。

親合素主要包括卵白親合素、鏈親合素、卵黃親合素及類親合素等。后兩種因其特異性親合力低,研究不多,前兩種目前已深入研究并得到廣泛應(yīng)用。

1、親和素(AvidinA) 親合素又稱卵白蛋白或抗生物素,分子量為68000pI 1010.5;在pH 913緩沖液中性質(zhì)均穩(wěn)定,耐熱并耐多種蛋白水解酶的作用。天然親合素為堿性蛋白,由4個相同的亞單位構(gòu)成4聚體;每個親合素亞單位通過其結(jié)構(gòu)中的色氨酸殘基與生物素中的Ureido環(huán)結(jié)合。因此,1個親合素分子存在4個與生物素分子結(jié)合位點,其結(jié)合常數(shù)(Ka)高達1015mol/L。

通常,親合素的活性單位是以親合素結(jié)合生物素的量來表示的,即以能結(jié)合1Pg生物素所需要的親合素量為1個親合素活性單位。一般1Pg親合素約含1315個活性單位。

2、鏈霉親合素(Streptavidin,SA) 鏈霉親合素(SA)是與親合素(A)有類似生物學(xué)特性的一種蛋白質(zhì)。是由Streptomyces avidin菌在培養(yǎng)過程中分泌的一種蛋白質(zhì)產(chǎn)物,SA也可通過基因工程手段生產(chǎn)。SA分子量為65000,由4條序列相同的肽鏈構(gòu)成,每條SA肽鏈可以結(jié)合1個生物素分子。因此與A一樣,每個SA分子也具有4個可與生物素分子結(jié)合位點,其結(jié)合常數(shù)與A相同為1015mol/L。約為抗原抗體間Ka (1051011 mol/L)1萬倍以上。

SAAka雖然相同,但在實際應(yīng)用中其檢測靈敏度明顯優(yōu)于A,其原因是SA為略偏酸性的蛋白。SA的每條肽鏈含159個氨基酸殘基,其中賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的含量比一般親合素少,反之含酸性氨基酸較多,其等點為6.0,較A(pI10)為低,同時在結(jié)構(gòu)中SA不含任何糖基,而A含糖可高達10%。A的高pI及高含糖結(jié)構(gòu)導(dǎo)致在聚苯乙烯板和硝酸纖維素膜上或與組織細胞DNA結(jié)合時,易產(chǎn)生一定程度的非特異性結(jié)合,造成較高的顯色背景,而SAA在應(yīng)用中明顯克服了這一缺點。

SAzui高的活性可達18u,A(15u);與A一樣,每個SA分子也具有4個可與生物素分子結(jié)合位點,故其效應(yīng)相同。 

生物素-親合素不僅可與多種標記物穩(wěn)定結(jié)合,而且能偶聯(lián)抗體等大分子物質(zhì),因此建立了許多檢測方法,成為免疫學(xué)、分子生物學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的新技術(shù)系統(tǒng)之一。

生物素-親合素系統(tǒng)具有以下顯著特點:

1、高度特異性 生物素-親合素系統(tǒng)的結(jié)合反應(yīng)因其親合力*而呈現(xiàn)高度專一性,生物素、親合素一旦結(jié)合則很難分離,這種高度特異、穩(wěn)定地結(jié)合,使反應(yīng)試劑可經(jīng)得起高度稀釋,因而可明顯降低或避免了反應(yīng)中可能存在的非特異性作用。

2、高度靈敏性 親合素可通過4個結(jié)合位點多價橋聯(lián)生物素的反應(yīng)物和標記物。另外,生物素化的大分子蛋白、核酸、酶等物質(zhì)不僅保持其活性不受影響,更因生物素化形成許多"觸手"的多價制劑,使整個反應(yīng)體系出現(xiàn)多級放大效應(yīng),因而賦予BAS*的靈敏性。

3、簡易、快速、安全、穩(wěn)定、BAS的高度特異性及靈敏性,使其在反應(yīng)體系應(yīng)用中用量極微,故成本低廉。反應(yīng)程序于數(shù)小時即完成,結(jié)果易觀察。生物素標記試劑可于4℃存放兩年而效價不變。

4、應(yīng)用廣泛 BAS可與多種標記系統(tǒng)如酶、熒光素、鐵蛋白、凝集素、SPA、放射性核素等聯(lián)合用于抗原、抗體、蛋白、激素、受體、核酸系統(tǒng)等多種生物學(xué)反應(yīng)體系,也可作為親合介質(zhì)用于上述各類反應(yīng)體系中反應(yīng)物的分離、純化。近年研究提出,生物素親合素系統(tǒng)尚可作為均相酶免疫試驗中的酶活性調(diào)變系統(tǒng)及新型的標記生物免疫傳感器系統(tǒng),因此,BAS有著極廣的研究與應(yīng)用潛力。

 

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