酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)

    酶聯(lián)免疫斑點(diǎn) ( enzyme-linked immunosorbent spot, ELISPOT) 檢測(cè)技術(shù)是通過(guò)兩種高親和力的特異性抗細(xì)胞因子抗體來(lái)檢測(cè)淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子情況的一種方法。

    淋巴細(xì)胞在體內(nèi)被抗原激活后，或者在體外培養(yǎng)中被培養(yǎng)液中含有的特異性抗原或刺激劑激活后，將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)入ELISPOT培養(yǎng)板中。這些活化的淋巴細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，在孵育的過(guò)程中可在分泌細(xì)胞原位被ELISPOT培養(yǎng)板上包被的特異性細(xì)胞因子抗體所捕獲。

    將細(xì)胞和過(guò)量的細(xì)胞因子洗除后，加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，孵育后洗去多余檢測(cè)抗體。然后加入酶標(biāo)記的鏈親和素（二抗），孵育后洗去多余酶標(biāo)鏈親和素（二抗）。zui后加入酶的底物，作用后可形成不溶的顏色產(chǎn)物即斑點(diǎn)（SPOT）。每個(gè)斑點(diǎn)是激活的淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子區(qū)域，代表一個(gè)活性淋巴細(xì)胞。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果可在顯微鏡下觀察或使用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)自動(dòng)圖象分析儀（BioReader 4000 Pro-X）來(lái)進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。該方法可在單細(xì)胞水平檢測(cè)淋巴細(xì)胞對(duì)特異性抗原的反應(yīng)能力及記數(shù)特異性抗原刺激下分泌性淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的情況。

    ELISPOT比ELISA靈敏度高102～103倍。ELISPOT不僅能分析細(xì)胞因子分泌的總量變化，更能*檢測(cè)活化淋巴細(xì)胞的數(shù)量變化。ELISPOT可到檢測(cè)出一百萬(wàn)個(gè)淋巴細(xì)胞中的一個(gè)活化細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌。

    理論上講，所有能分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞都可以用ELISPOT進(jìn)行檢測(cè)分析。實(shí)際應(yīng)用中常見(jiàn)的檢測(cè)細(xì)胞類型包括：外周血淋巴細(xì)胞（PBMC）、骨髓、或者中樞神經(jīng)系統(tǒng)和淋巴組織的單細(xì)胞懸液。

    ELISPOT是一個(gè)嶄新的技術(shù)平臺(tái)，它適用于多種免疫學(xué)研究的分析。對(duì)于疫苗研究，中國(guó)藥品生物制品檢定所在《預(yù)防用DNA疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則》及《預(yù)防用以病毒為載體的活疫苗制劑的技術(shù)指標(biāo)原則》等規(guī)定中均指出，ELISPOT是檢測(cè)和評(píng)價(jià)疫苗的細(xì)胞免疫的有效方法。