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上海聯(lián)碩生物科技有限公司
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ELISA方法詳細過程及步驟2009/06/22
ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay）的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項技術(shù)自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。（一）原理ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物
免疫膠體金技術(shù)（Immune colloidal gold technique）2009/06/22
一）原理免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒
免疫共沉淀 簡介2009/06/17
蛋白質(zhì)間相互作用研究方法：免疫共沉淀1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10cm培養(yǎng)板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。2．將每毫升細胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在微量離心機上4℃以zui大速度離心15min。3．收集上清（約30ml）并加入30μg的適當(dāng)抗體，4℃搖動免疫沉淀物1h。4．加入0.9ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose懸液，4℃搖動免疫沉淀物30min。5．用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復(fù)洗5次。zui后，用NE
抗原的制備方法2009/06/17
除完整的細胞可作為抗原外，各種不同的細胞內(nèi)存在的各種分子量不同的物質(zhì)，也都具有全抗原或半抗原的性質(zhì)，某種抗原物質(zhì)可能是某一類細胞所*的，可作為這種細胞的一個標(biāo)志。由于細胞存在著許多性質(zhì)不同的抗原物質(zhì)，有時要從這眾多的物質(zhì)中提取、純化某種抗原物質(zhì)，以供科學(xué)研究之用。一、抗原的提取抗原的制備是一件十分細致的工作，要制備一個高純度的抗原，需要付出艱巨的努力，制備工作涉及物理學(xué)、化學(xué)和生理學(xué)等許多領(lǐng)域的知識。根據(jù)物理或化學(xué)特性建立起來的分離、純化方法的主要原理不外乎科二個方面：①利用混合物中幾個組分分配
ICC用細胞抗原的制備2009/06/17
一、材料和試劑1、0.01MPBS（pH7.4）：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；ddH2O至1000ml；高壓滅菌,分裝。2、0.25%胰酶：稱取EDTA0.02gNaCl0.8gKCl0.04g加三蒸水100ml溶解后加0.25g胰酶,輕輕攪動,使胰酶溶解,不要產(chǎn)生泡沫,加酚紅少許,調(diào)PH值到8.2-8.6,過濾除菌,分裝10ml/管,-20℃保存,臨用前預(yù)溫到37℃。3、誘導(dǎo)液（TPA）：12-鄰-十四酰-佛波醇-13-乙酸酯（12-O-
雙向瓊脂擴散實驗2009/06/17
雙向瓊脂擴散實驗，是將抗原和相應(yīng)抗體分別加入同一凝膠板內(nèi)的相鄰小孔中。兩者相互擴散,當(dāng)擴散到他們的濃度比例合適的部位相遇時,就會形成抗原抗體復(fù)合物的沉淀。二、操作步驟1.取一塊干凈的玻璃板，用少量75%乙醇沖洗，晾干后置于水平臺，將1%瓊脂糖融化，56℃水浴中保溫。2.將瓊脂糖鋪于玻璃板上，厚度約為1㎜。3.打孔，孔距為4㎜，4.將抗血清按二倍稀釋法稀釋成1:2,1:4,1:8,1:16,1:32的不同濃度。在周圍孔中加入不同濃度的抗體，中心孔加抗原。將凝膠板置于濕盒內(nèi)，室溫過夜，觀察結(jié)果三、實
HLA分型技術(shù)2009/06/17
HLA分型技術(shù)主要組織相容性復(fù)合物（MHC）是脊椎動物體內(nèi)zui復(fù)雜且具有高度多態(tài)性的基因群。1984年GeorgeSnell發(fā)現(xiàn)小鼠MHC即H－2，1958年Dausset發(fā)現(xiàn)了人的MHC即HLA基因。MHC的表達產(chǎn)物稱為主要組織相容性抗原，MHC抗原是有核細胞表面膜蛋白分子，對抗原遞呈和免疫信號傳遞起關(guān)鍵作用。HLA基因，位于6號染色體上短臂上，長約4000Kb。HLA是目前所知人體zui復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，有幾十個基因座位，每個基因座位又有幾十個等位基因，且呈共顯性表達。由于MHC基因位
凝膠沉淀反應(yīng)2009/06/17
一、單相瓊脂擴散試驗原理一種定量試驗，將一定量的抗體混合于瓊脂內(nèi)，傾注于玻片上，凝固后，在瓊脂層上打孔，再將抗原加入孔中，使其向四周擴散。抗原抗體復(fù)合物形成的沉淀環(huán)直徑與抗原的濃度成正比。如事先用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，則未知標(biāo)本中的抗原含量即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出。本試驗主要用于檢查標(biāo)本中各種免疫球蛋白和血清IgG含量。材料１．抗體：羊抗人IgG單價抗血清。２．抗原：待檢血清。３．３％生理鹽水瓊脂、生理鹽水、載玻片、直徑３mm打孔器、小三角燒瓶、毛細滴管、濕盒。方法1、制備含抗體的瓊脂板取
間接凝集反應(yīng)（類風(fēng)濕因子檢測） 2009/06/17
原理類風(fēng)濕因子（rheumatoidfactorRF）是抗人或動物IgGFc段的抗體，是以變性IgG為靶抗原的自身抗體。IgM型RF被認(rèn)為是RF的主要類型，也是臨床免疫檢驗中常規(guī)方法所測定的類型。IgG吸附于聚苯乙烯膠乳顆粒上作為檢測試劑，在反應(yīng)介質(zhì)中，待檢血清中如含有RF，可與膠乳顆粒出現(xiàn)凝集反應(yīng)。這是檢測IgM型RF的常用方法，但此方法只能定性或以滴度半定量，其靈敏度和特異性均不高，且只能檢出血清中的IgM型RF。檢測方法：膠乳顆粒凝集試驗即一定稀釋度的待檢血清+Ig-膠乳顆粒1~2滴凝集與
血清學(xué)技術(shù)2009/06/17
握體外抗原抗體反應(yīng)的特點和影響因素；掌握經(jīng)典的體外抗原抗體反應(yīng)的原理、方法和應(yīng)用。*節(jié)免疫血清的制備免疫血清的制備是一項常用的免疫學(xué)實驗技術(shù)。價、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑（如用于制備免疫標(biāo)記抗體等），也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效價高低取決于實驗動物的免疫反應(yīng)性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強的抗原刺激高應(yīng)答性的機體，?？色@得價的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時，則需同時加用佐劑以增強抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決于免疫用抗原的純度。因此，如欲獲得高特異性的
ELISA的操作要點2009/06/17
的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗一般均用板式點。本文將敘述板式ELISA各個操作步驟的注意要點，珠式、管式及磁性球ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用，兩者均有詳細的使用說明，嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。4.1標(biāo)本的采取和保存可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進行測定（如
ELISA實驗質(zhì)量控制問題2009/06/17
從1949年美國CollegeofAmericanPathologists（簡稱CAP）首先開始研究臨床實驗室室內(nèi)質(zhì)量控制（簡稱質(zhì)控）問題，美國學(xué)者Levery和Jenning于1950年發(fā)表*篇關(guān)于使用質(zhì)控圖的實驗室室內(nèi)質(zhì)控，臨床檢驗實驗室的室內(nèi)質(zhì)控工作正式拉序幕。到70年代，實驗室質(zhì)量控制進入一個新的階段--全面質(zhì)量管理，推行GoodLaboratoryParctice（簡稱GLP）。進入80年代末期，GLP的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生了，發(fā)展到"認(rèn)證實驗室"管理階段。全面質(zhì)量管理的宗旨在于預(yù)防差錯的產(chǎn)生
ELISA試劑的臨床質(zhì)量評價2009/06/17
ELISA試劑的評價（evaluation）分兩個方面：一是試劑本身的質(zhì)量評價，符合一定要求后才能生產(chǎn)供應(yīng)；一是在臨床應(yīng)用中效果的評價。以肝炎ELISA診斷試劑為例，首先必須通過中國藥品生物制品檢定，以得到生產(chǎn)的許可。檢定內(nèi)容除包裝、標(biāo)簽、說明書等外，對試劑的性能，如特異性、靈敏度、精密度和線性等均需逐項檢定，通過對一系列參比品的檢測，結(jié)果符合要求者才為合格。ELISA試劑的臨床質(zhì)量評價是用該試劑對臨床樣本進行檢測，以觀察其實際應(yīng)用價值。部臨檢中心對乙肝ELISA診斷試劑在這方面進行了工作，通過
ELISA的概念、原理、操作步驟2009/06/17
ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay）的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項技術(shù)自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。（一）原理ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物
影響ELISA試驗效果常見問題原因分析及解決辦法2009/06/17
ELISA試驗以靈敏度較高、特異性較好的特點在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，但操作中的各個環(huán)節(jié)對試驗的檢測效果影響較大，如不注意，有可能導(dǎo)致顯色不全、花板等結(jié)果。我將操作中各個環(huán)節(jié)常出現(xiàn)問題的原因及解決辦法總結(jié)于下，以期給同行帶來一些啟發(fā)，提高試驗質(zhì)量。操作步驟可能原因解決辦法選擇試劑選擇質(zhì)量優(yōu)良的檢測試劑，嚴(yán)格按照試劑說明書進行操作，操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。加樣1.血清或血漿標(biāo)本分離不好即進行加樣；2.手工操作中，加樣板過多造成加樣后放入孵箱前等待時間過長（特別是室內(nèi)溫度較高時）；3
酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）基本原理2009/06/16
基本原理1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法。這一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步
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