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IL-1的免疫學(xué)測(cè)定法2012/06/09: 以放射免疫法為例。其原理是利用樣品IL-1與125I標(biāo)記的IL-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合吸附在Sepharose4B上的多克隆抗IL-1抗體以測(cè)定其含量，該方法可排除其他因子的干擾，還可區(qū)分IL-la和Iblb操作步驟如下：①將純化的抗IL-1抗體結(jié)合于Sepharose4B上，然后懸于PBS中；②加一定稀釋度的IL-1待測(cè)樣品，置室溫24h；③再加lz51標(biāo)記IL-1至每個(gè)實(shí)驗(yàn)管中，作用24h；④2500r／min離心10min去除上清液，再用蒸餾水洗1次；⑤測(cè)上清液、洗液（F）及沉淀（B）中的放射活性，從

氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的定性鑒定2012/06/02: 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）學(xué)習(xí)一種鑒定氨基轉(zhuǎn)移作用的簡(jiǎn)便方法及其原理；（2）進(jìn)一步掌握紙層析的原理和操作技術(shù)；（3）了解氨基轉(zhuǎn)移作用在中間代謝中的意義。二、實(shí)驗(yàn)原理氨基移換酶也稱(chēng)轉(zhuǎn)氨酶，它能催化α-氨基酸的氨基與α-酮酸的α-酮基互換，這種作用稱(chēng)為氨基移換作用。它在生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與分解等中間代謝中，在糖、脂肪、蛋白質(zhì)三類(lèi)物質(zhì)代謝的相互、相互轉(zhuǎn)化上，都起著很重要的作用。任何一種氨基酸進(jìn)行轉(zhuǎn)氨作用時(shí)，都由其專(zhuān)一的轉(zhuǎn)氨酶催化。它們的zui適pH接近7.4。在各種轉(zhuǎn)氨酶中，以谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（簡(jiǎn)稱(chēng)谷

離心技術(shù)2012/06/02: 離心技術(shù)是根據(jù)顆粒在勻迷圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)受到一個(gè)外向的離心力的行為發(fā)展起來(lái)的一種分離分析技術(shù)。1、用于工業(yè)生產(chǎn)的，如化工、制藥、食品等工業(yè)大型制備用的離心技術(shù)，轉(zhuǎn)速都在每分鐘5000轉(zhuǎn)以下。2、用于生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等實(shí)驗(yàn)室分析研究的，轉(zhuǎn)速?gòu)拿糠昼妿浊У綆兹f(wàn)轉(zhuǎn)以上，此類(lèi)技術(shù)的使用目的在于分離和純化樣品，以及對(duì)純化樣品的有關(guān)性能進(jìn)行研究?；驹?、離心力Centrifugalforce（F）F=mω2rω：旋轉(zhuǎn)角速度（弧度／秒）r:旋轉(zhuǎn)體離旋轉(zhuǎn)軸的距離（cm）m：顆粒質(zhì)量2、相對(duì)離心力Relativec

幾種常用的蛋白鑒定方法2012/06/02: 傳統(tǒng)的蛋白鑒定方法，如免疫印跡法、內(nèi)肽的化學(xué)測(cè)序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一個(gè)有機(jī)體中有意義的基因的過(guò)表達(dá)通常耗時(shí)、耗力，不適合高流通量的篩選。目前，所選用的技術(shù)包括對(duì)于蛋白鑒定的圖象分析、微量測(cè)序、進(jìn)一步對(duì)肽片段進(jìn)行鑒定的氨基酸組分分析和與質(zhì)譜相關(guān)的技術(shù)。1圖象分析技術(shù)（Imageanalysis）“滿天星”式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的直覺(jué)，每一個(gè)圖象上斑點(diǎn)的上調(diào)、下調(diào)及出現(xiàn)、消失，都可能在生理和病理狀態(tài)下產(chǎn)生，必須依靠計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)處理，進(jìn)行定量分析。在一

生化與細(xì)胞所等發(fā)現(xiàn)索拉菲尼改善肝纖維化的新機(jī)制2012/06/02: 2011年5月，學(xué)術(shù)刊物Hepatology刊登了中科院上海生命科學(xué)研究院生化與細(xì)胞所丁小燕實(shí)驗(yàn)室的研究成果。該研究發(fā)現(xiàn)索拉菲尼（sorafenib）改善肝纖維化的新機(jī)制。中國(guó)是“肝病大國(guó)”，肝纖維化作為多種慢性肝病病理發(fā)生過(guò)程的重要特征，一直是肝病研究和治療領(lǐng)域所關(guān)注的重要課題之一。肝纖維化成因復(fù)雜，TGF-b是目前已知zui重要的促肝纖維化因子。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在受到損傷和炎癥時(shí)分泌TGF-b，刺激并活化肝星狀細(xì)胞，同時(shí)誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生EMT（epithelial-mesenchymaltran

過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶復(fù)合物的制備2012/06/02: 試劑及配制1.HRP和兔（或羊）抗HRP：抗HRP用HRP免疫兔（或羊）獲得。2.0.075mol/L醋酸鈉-0.15mol/L醋酸銨等量混合液3.0.1mol/LHCl和0.01mol/LHCl4.飽和硫酸銨溶液5.0.01mol/LNaOH操作方法1.取兔（或羊）抗HRP血清5ml，16000r/min離心20min，去沉淀；2.于收集的上清中加入HRP（2mg/ml）溶液1ml，室溫緩慢攪拌1h，同上離心；3.沉淀物用冷生理鹽水洗滌3次，棄上清；4.于沉淀中加入HRP（2mg/ml）溶液4

磷酸鹽緩沖液（PB）的配制2012/06/02: 1.A液（0.2M磷酸二氫鈉水溶液）：NaH2PO4?H2O27.6g，溶于蒸餾水中，稀釋至1000ml。2.B液（0.2M磷酸氫二鈉水溶液）：Na2HPO4?7H2O53.6g（或Na2HPO4?12H2O71.6g或Na2HPO4?2H2O35.6g）加蒸餾水溶解，加水至1000ml。3.不同pH值磷酸鹽緩沖液（PB）緩沖液的配制A液Xml（參照下表）中，加入B液Yml，為0.2MPB。若再加蒸餾水至200ml則成0.1MPB。PHXmlYmlpHXmlYml5.793.56.56.945.

IL-4抗CD23單抗檢測(cè)法2012/05/26: IL-4能促進(jìn)B細(xì)胞膜表面CD23分子表達(dá)，一些BurkittB淋巴細(xì)胞瘤株（如Jijoy細(xì)胞）未受刺激時(shí)，CD23表達(dá)水平很低，經(jīng)IL-4刺激后，CD23的表達(dá)呈劑量依賴(lài)性增加。用抗CD23單抗間接免疫熒光法染色，可檢測(cè)人IL-4活性。（1）將5X105／mL的Jiioy細(xì)胞培養(yǎng)于含10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液中。（2）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)液將細(xì)胞配成5X105／mL，接種于24孔板中，lmL／孔。分別加待測(cè)標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)IL-4（不同稀釋度），并設(shè)陰性對(duì)照，培養(yǎng)48～72h。（

IL-4的檢測(cè)生物學(xué)及免疫學(xué)方法2012/05/26: 1、IL-4與LPS共刺激B細(xì)胞分泌IgG1和IgE的測(cè)定小鼠B淋巴細(xì)胞在LPS刺激下首先分泌IgM和IgG3、IgG2b。當(dāng)IL-4作用于LPS刺激的B細(xì)胞時(shí)，IgM、ISC3、IgG2b合成產(chǎn)物明顯減少，而IgE、IgCl合成產(chǎn)物顯著地增加。在細(xì)胞培養(yǎng)5-6d后，收獲上清，通過(guò)對(duì)IgE和IgCl測(cè)定，間接了解IL-4的含量。IgE測(cè)定用放射免疫法；IgCl含量測(cè)定可采用雙抗體ELISA夾心法。2、依賴(lài)株CT．4S的增殖試驗(yàn)CT．4S細(xì)胞是依賴(lài)于IL-4，對(duì)IL-2低反應(yīng)的CTLL變異株，其增

白介素5（IL-5）的檢測(cè)2012/05/19: 1．依賴(lài)細(xì)胞株增殖法IL-5依賴(lài)株有CHl2、B13、T88-M和BCLl細(xì)胞，其培養(yǎng)條件和操作步驟與用CTLL-2細(xì)胞3H-TdR摻人法檢測(cè)IL-2類(lèi)似，推薦細(xì)胞濃度和加3H-TdR前后的培養(yǎng)時(shí)間見(jiàn)表。各種IL-5依賴(lài)細(xì)胞株檢測(cè)ID5的參考實(shí)驗(yàn)條件細(xì)胞株細(xì)胞濃度加3H-TdR前培養(yǎng)時(shí)間加3H．TdR后培養(yǎng)時(shí)間CHl25×l103／mL48h6hB135×104／mL36h12hT88-M5×105／mL24h12hBCL15×105／mL72h6h2．DXS共刺激B細(xì)胞增殖法（1）常規(guī)制作B細(xì)

白介素5（IL-5）的誘生2012/05/19: IL-5由TH細(xì)胞產(chǎn)生，其主要靶細(xì)胞是B細(xì)胞，兼有促進(jìn)B細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的雙重功能，亦對(duì)T細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞有一定的作用。1．B151K12細(xì)胞和2．19T細(xì)胞上清B151．K12和2．19T細(xì)胞均可自發(fā)分泌IL-5，前者以2×105／ml濃度培養(yǎng)36h，后者以5×1105／mL濃度培養(yǎng)24h，其上清即為含IL-5的標(biāo)本。2．ConA誘生MB2-1細(xì)胞上清MB2—1T細(xì)胞系為T(mén)H2克隆所得，培養(yǎng)于10％NBS-IMDM培養(yǎng)液中。首先，將MB2-1細(xì)胞用Hanks液離心洗一次，用10％NBS-IMD

IL-8的誘生與IL—8的免疫學(xué)檢測(cè)2012/05/12: IL-8由單核／巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，其主要生物活性是激活中性粒細(xì)胞。多用人外周血或臍帶血單個(gè)核細(xì)胞，也可用體外培養(yǎng)傳代細(xì)胞系。LPS、PHA、ConA、IL-i、TNFa均是較理想的刺激劑。1．常規(guī)分離PBMC，洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5X106／mL。2．加入終濃度為1ug／mL的LPS及10mg／mL的PI-IA，混勻后置37％，5％C02溫箱中培養(yǎng)48h，離心收集上清。3．用HCl將培養(yǎng)上清調(diào)為酸性（pI-14．0），經(jīng)SephadexG-75柱分離，收集

中性粒細(xì)胞趨化試驗(yàn)檢測(cè)IL-82012/05/12: ID8是中性粒細(xì)胞的激活劑和趨化因子；本法通過(guò)檢測(cè)中性粒細(xì)胞的遷移距離來(lái)反映IL-8活性。（1）配制2倍濃度的DMEM培養(yǎng)液100mL，其中含20mL的FCS，75mgNaHC03，置48C水浴預(yù)溫。（2）配制2％瓊脂糖，水浴中保溫48℃左右時(shí)，與上述2XDMEM等量混勻。（3）制片（3mlJ片），室溫凝固后，放4~C30～60min進(jìn)一步凝固，打孔。（4）分離人外周血中性粒細(xì)胞，用DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度為2．5×105／mL，取lOgL細(xì)胞懸液加人各組中心孔，上孔分別加10／uL含趨化因子的待檢

B9-11細(xì)胞增殖法檢測(cè)IL—112012/05/05: 通過(guò)對(duì)B9細(xì)胞的反復(fù)克隆，篩選出對(duì)IL-11高度敏感的B9-11細(xì)胞株，可用于IL11的檢測(cè)。1．B9-11細(xì)胞的克隆①向96孔培養(yǎng)板中每孔加入100uL含5％FCS和100ng／mLrIL-11的PMI-1640培養(yǎng)液；②加B9-11細(xì)胞于每孔l、3、9和27個(gè)細(xì)胞，每一細(xì)胞濃度做一板，培養(yǎng)2周，陽(yáng)性生長(zhǎng)孔定期更換培養(yǎng)液和補(bǔ)充rIL-1③取出生長(zhǎng)較好孔內(nèi)細(xì)胞，測(cè)其對(duì)IL-11的敏感度，所需IL-11濃度zui低的細(xì)胞克隆為B9-11克隆。2．在96孔板中每孔加50rtl用含5％FCSRPMI-

抗體捕捉生物測(cè)定法檢測(cè)IL—122012/05/05: IL-12由B細(xì)胞產(chǎn)生，由分子量分別為35kD和40kD兩個(gè)亞基通過(guò)二硫鍵連接而成，其功能為誘導(dǎo)T細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-7；增強(qiáng)T細(xì)胞、NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，促進(jìn)激活的T細(xì)胞、NK細(xì)胞增殖。利用鼠抗人IL-12McAb（可自Roche公司購(gòu)得）測(cè)IL-12濃度。1．用包被緩沖液（pH9．5的碳酸鈉緩沖液）稀釋包被抗體為15ug／mL，在96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，每孔加100rtl，室溫包被過(guò)夜。2．洗滌后加封閉液（含1％BSA的磷酸鹽緩沖液）每孑L2001uL，37℃1h。3．在試管中稀釋IL-12

淋巴母細(xì)胞增殖法檢測(cè)IL—122012/04/21: 本法利用IL-12促進(jìn)PHA激活的人淋巴母細(xì)胞增殖來(lái)測(cè)定IL-12含量，這是目前定量測(cè)定IL-12的方法，操作亦較簡(jiǎn)單，但因IL-2、IL-4和IL-7亦可促進(jìn)PHA激活的淋巴母細(xì)胞增殖，故此法不宜用于可能含多種細(xì)胞因子標(biāo)本的測(cè)定。1．用*培養(yǎng)液稀釋人或鼠IL-12標(biāo)準(zhǔn)品分別至2ng／mL和4nz／mL，然后進(jìn)行5倍系列稀釋共3個(gè)稀釋度。2．系列稀釋待檢標(biāo)本，使其IL-12濃度大致處于2—20ng／mL范圍。3．向96孔板加PHA激活的人淋巴母細(xì)胞50uL／孔（終濃度2X104／mL）。4．加4

IFN-γ誘生法檢測(cè)IL—122012/04/21: 其原理為IL-12能激活外周血淋巴細(xì)胞（PBL）產(chǎn)生IFN-γ，在一定范圍內(nèi)誘生的IFN-γ量與IL-12的量呈劑量相關(guān)性。1．在96孔培養(yǎng)板中每孔加i00~L106個(gè)PBL細(xì)胞。2．將待測(cè)樣本系列稀釋?zhuān)謩e加入各孔，lOOtuL／孔，并用不同稀釋度的I[,-12標(biāo)準(zhǔn)晶作對(duì)照。3．培養(yǎng)18h后，取上清100~tL，測(cè)IFN-~活性（方法見(jiàn)本章第三節(jié)）。IL-12的活性單位定義為：能誘導(dǎo)IFN-7zui大產(chǎn)率50％的IL-12量稱(chēng)為1個(gè)IL-12活性單位。尚有LAK殺傷活性法，其原理是IL-12和

自動(dòng)DNA合成儀的日常維護(hù)2012/04/14: 1．瓶塞“O”形環(huán)一月檢查一次“O”形環(huán)，zui少1年更換1次。將新的備用“O”形環(huán)與儀器上的相比較，如果在“O”形環(huán)上出現(xiàn)白色沉淀，用棉花蘸取乙腈，進(jìn)行清洗。更換“O”形環(huán)的步驟如下：用止血鉗夾住“O”形環(huán)，從槽中取下（或用牙簽鉤下），注意不要損壞托住“O”形環(huán)的白色聚氟乙烯插塞（tefloninsert）；確保插塞上沒(méi)有顆粒后，用手指將新“O”形環(huán)推進(jìn)槽，進(jìn)行壓力實(shí)驗(yàn)。2．儲(chǔ)液瓶瓶子都要放在亞磷酰胺及儲(chǔ)液瓶位置上，并保持氬氣壓力以及管路清潔。3．流路節(jié)流閥為了防止阻塞，節(jié)流閥應(yīng)該1個(gè)月清洗1

DNA合成儀的發(fā)展2012/04/14: 當(dāng)前DNA合成儀的主要生產(chǎn)廠商都致力于機(jī)器性能的完善和應(yīng)用領(lǐng)域的開(kāi)拓以及率、高產(chǎn)率的儀器的開(kāi)發(fā)與研究。中國(guó)臺(tái)灣科學(xué)委員會(huì)“基因醫(yī)藥衛(wèi)生科技研究計(jì)劃”中的基因生物技術(shù)組已經(jīng)成功研發(fā)**臺(tái)高密度復(fù)制DNA合成儀，可以同時(shí)合成384條不同DNA，每日可合成768條DNA，并可以配合聚合酶連鎖反應(yīng)裝置，大量復(fù)制各種基因，不但節(jié)省時(shí)間，也可節(jié)省大量人力，這部機(jī)器能復(fù)制動(dòng)物、人體、植物的基因甚至是防偽基因。由于人們所需要的大部分核酸的堿基對(duì)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)目前DNA合成儀可以合成的zui長(zhǎng)核酸鏈的堿基對(duì)數(shù)量，因

蛋白質(zhì)的膠體金標(biāo)記2012/04/07: 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的zui適穩(wěn)定量及標(biāo)記的*pH值被確定以后，便可進(jìn)行標(biāo)記。具體步驟如下。（1）根據(jù)標(biāo)記所用膠體金的總量計(jì)算出所需要待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量。（2）邊攪拌邊將蛋白質(zhì)溶液加入膠體金溶液中，逐漸加入，lmg的蛋白質(zhì)量大約需5min，或在攪拌下將膠體金逐漸加入到蛋白質(zhì)溶液中，大約需5～10min。（3）繼續(xù)攪拌10min，然后加入5％BSA使其終濃度為1％，或加入3％聚乙二醇（PEG，Mr：20000）使其終濃度為0．05％，其效果BSA要優(yōu)于PEG。（4）將標(biāo)記好的膠體金裝入透析袋中，兩頭扎緊，放人

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