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【感受態(tài)細胞的制備】 用CaCl2處理制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細胞2013/05/15

1.從37℃培養(yǎng)16~20h的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌DH52），或1ml新鮮的16~20h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml培養(yǎng)瓶中。于37℃振搖培養(yǎng)約2~3h（旋轉(zhuǎn)搖床200~300r/min），每隔20~30min測量OD600值≈0.4。2.在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，冰上放置10~20min。3.于4℃4000轉(zhuǎn)/分離心10min，回收細菌細胞。4.將管倒置1min，以使zui后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。5.以10

【感受態(tài)細胞的制備】 電擊和熱擊感受態(tài)細胞的制備2013/05/15

實驗試劑LB培養(yǎng)基，KB培養(yǎng)基，10%甘油，液氮，0.1MCaC12溶液實驗設備超凈工作臺，搖床，離心機，250mL離心瓶，0.5mL的離心管實驗材料大腸桿菌，農(nóng)桿菌和假單胞桿菌實驗步驟1.電擊感受態(tài)細胞的制備1）-80℃保存的大腸桿菌，農(nóng)桿菌或者假單胞桿菌在固體平板上（DH，BL21在LB平板上，GV3101在LB/Gen;P.s.pv.tomato0288-9和P.syringaepv.tabaci6505在KB平板上）劃線。2）接種單克隆于5-10mL液體培養(yǎng)基，37℃（大腸桿菌）或者28

細胞表面抗原染色2013/04/24

細胞表面分子流式檢測步驟說明注意事項1．在使用抗體之前，快速甩動一下，使之聚集到管的底部；2．熒光標記的抗體應該避光保存在4℃，不要冷凍；3．當染色的時候，固定或延遲分析可能降低某些抗體的熒光信號。為了得到更好的結(jié)果，染色后應該馬上分析。過程概述：1．制作外周血、淋巴組織或者培養(yǎng)細胞的單細胞懸液；2．細胞染色抗體（包括直接標記抗體和間接標記抗體）；3．洗滌步驟棄掉所有的為束縛的試劑4．運行分析流式儀。注意：流式細胞染色實驗中，所有實驗條件的優(yōu)化都很重要。關鍵參數(shù)包括靶細胞、抗體效價以及動力學。試

流式胞內(nèi)染色實驗方法2013/04/24

方案A：兩步法胞內(nèi)（細胞質(zhì)）蛋白染色。方案B：一步法胞內(nèi)蛋白染色（細胞核）。注意：1、不同細胞因子的刺激條件是不同的，比如：LPS刺激活化單核細胞分泌IL-6的培養(yǎng)時間一般是6個小時，而檢測IL-10則需要刺激24小時。2、結(jié)合熒光的流式抗體應在4度，避光儲存。3、使用抗體前請低速離心30秒，使貼壁抗體沉底。不建議斡旋混勻抗體，可用手指輕彈混勻。4、除非方案中注明，默認的抗體孵育方法是冰上或4度避光。5、緩沖液中加BSA或FBS可以減少固定破膜后的非特異性背景。方案A:兩步法胞內(nèi)（細胞質(zhì)）蛋白染

流式表面抗原染色方法2013/04/24

方案A：細胞懸液的表面抗原染色。方案B：一步法胞內(nèi)蛋白染色（細胞核）。小貼士：1、流式抗體要儲存于避光4度，嚴格避免凍融。2、流式抗體使用前要離心3min，避免貼壁蓋的損失，請勿斡旋混勻。3、避免細胞成團，以免堵塞流式細胞儀。4、eFluor納米晶體抗體參照該品說明進行改善。方案A:細胞懸液的表面抗原染色實驗材料：15×75mm圓底流式管或96孔板直標一抗或純化抗體二抗（可選）抗小鼠CD32/16抗體（eBioscienceCat.No.14-0161）人FC?R結(jié)合抑制劑（eBioscienc

流式檢測細胞樣品的制備2013/04/24

方案A：組織培養(yǎng)細胞的制備。方案B：淋巴組織細胞制備。方案C：非淋巴組織細胞制備。方案D：全血PBMC的分離。小貼士1、流式細胞儀檢測需要將細胞制備成單細胞懸液。2、避免細胞成團，以免堵塞流式細胞儀。3、實體組織制備單細胞懸液需要物理方法分離或酶消化法進行，具體組織的方法，依照經(jīng)驗來進行。方案A:組織培養(yǎng)細胞的制備實驗材料：Accutase™酶細胞分離培養(yǎng)基（eBioscienceCat.No.00-4555）eBioscience®流式染色緩沖液（eBioscienceCat.No.00-42

CaspGlow 實驗參考方案2013/04/24

以CaspGLOW™FluoresceinActiveCaspase-3StainingKit（88-7004）為例。1.根據(jù)文獻中方法誘導靶細胞凋亡，準備未誘導細胞作為陰性對照，另外一種陰性對照用1ulZ-VAD-FMK抑制劑制備。2.將細胞加入300ul*培養(yǎng)基中，濃度為1×106.3.加1ulFITC-DEVD-FMK在5%CO237攝氏度下孵育30~60min.4.3000rpm，5min,移去上清。5.加入0.5mlwash-buffer洗滌細胞一次。6.重復步驟4和步驟5.7.流式細

各種細胞免疫檢測方法比較2013/04/15

類型檢測名稱檢測方法主要特點體內(nèi)功能檢驗遲發(fā)型超敏反應法皮下注射抗原或者負載抗原的DC，觀察紅斑、硬塊的發(fā)生與大小優(yōu)點：體內(nèi)功能性檢驗，相對比較容易操作；缺點：只是一種初篩，加陽性與假陰性比較嚴重。體外表型檢測TCR可變區(qū)分析法使用針對T細胞受體（TCR）可變區(qū)的流式抗體來對表達特定可變區(qū)的T細胞計數(shù)優(yōu)點：可以提供關于可變區(qū)使用的群體分布；缺點：識別同一種抗原的TCR的可變區(qū)可能不相同；單抗不夠豐富，不能檢測所有種類的可變區(qū)。多肽MHC四聚體法（Tetramer）用熒光標記的MHC-肽四聚體去結(jié)

重組細胞因子溶解小帖士2013/04/15

1．離心（Centrifuge）：高速離心（10,000rpm）20-30秒，或低速離心（2,000rpm）5分鐘。2．溶解（Reconstitution）：用去離子水或其它緩沖液（根據(jù)說明書要求進行選擇）溶解至說明書要求的濃度（一般為0.1-1.0mg/ml）。溶解時不可振蕩，避免因化學鍵的斷裂造成蛋白失活，可加入適當?shù)娜軇┹p搖并靜置一段時間，待細胞因子*溶解后使用。溶劑的選擇：1）要求用去離子水溶解的產(chǎn)品，務必不可用鹽溶液，避免過高的鹽濃度造成蛋白不可逆的析出；2）要求用鹽溶液溶解的產(chǎn)品，請

PeproTech重組細胞因子常見問題解答2013/04/15

PeproTech公司的重組細胞因子產(chǎn)品經(jīng)過了十分嚴格的生產(chǎn)、純化及質(zhì)檢過程，保證其在投放市場之前，達到如下要求：1.真實性：重組蛋白產(chǎn)品一致經(jīng)過N末端氨基酸序列分析；必要時應用SDS-PAGE,RP-HPLC和質(zhì)譜（MS）檢測其真實性。2.純度：應用SDS-PAGE和RP-HPLC方法分析產(chǎn)品純度。3.生物活性：進行相應的體外（invitro）或體內(nèi)（invivo）活性檢測。4.蛋白含量：通過紫外光譜分析，SDS-PAGE電泳檢測；必要時應用HPLC定量標準蛋白溶液。5.內(nèi)毒素：kinetic

抗原修復技術(shù)在免疫組化中的應用2013/04/15

福爾馬林固定時，組織中的許多氨基酸殘基在分子內(nèi)或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決定簇被封閉。同時，由于甲醛的聚合作用，使蛋白質(zhì)分子間相互交聯(lián)形成大分子網(wǎng)絡，也導致了抗原決定簇被掩蓋，這就使得相當部分的抗原不能與抗體很好是進行反應。因此，抗原修復也是影響免疫組化染色結(jié)果的基本因素。抗原修復（Antigenretrieval，AR）技術(shù)，建立在Fraenkel-conrat等人[1]一系列生物化學研究，經(jīng)1991年shi等人[2]發(fā)展?？乖迯褪侵甘?、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學（IHC）前

RNA干擾技術(shù)及其應用2013/04/15

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象，它是指當細胞中導入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA（doublestrandedRNA，dsRNA）時，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS）。外源dsRNA進入細胞后產(chǎn)生的小分子干擾RNA（smallinterferingRNA,siRNA）的反義鏈和多種核酸酶形

TUNEL法 檢測細胞凋亡2013/04/02

細胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH

DNA的片斷化檢測2013/04/02

細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成50~300kbp長的DNA大片段,或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜（DNAladder）。細胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNAladder。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNAlad

線粒體膜勢能的檢測2013/04/02

線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中zui早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine123、3，3-Dihexyloxacarbocyanineiodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazolcarb

磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）2013/04/02

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中（圖3）。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（propidineiodide,PI）是一種核酸染料，它不能

細胞凋亡的形態(tài)學檢測2013/04/02

細胞凋亡檢測方法細胞凋亡與壞死是兩種*不同的細胞凋亡形式，根據(jù)死亡細胞在形態(tài)學、生物化學和分子生物學上的差別，可以將二者區(qū)別開來。細胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹幾種常用的測定方法。一、細胞凋亡的形態(tài)學檢測根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征，人們已經(jīng)設計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學檢測方法。1光學顯微鏡和倒置顯微鏡（1）未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。（2）染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、

2013年Pierce蛋白組學新產(chǎn)品推薦2013/03/19

2013年Pierce蛋白組學新產(chǎn)品為了更好地推動蛋白質(zhì)組學研究的發(fā)展，ThermoScientificPierce推出了一系列產(chǎn)品。這些產(chǎn)品都是根據(jù)Pierce使用者的實際反饋意見來進行設計的，將給您的實驗帶來更大的便利。2013年我們將不斷推出產(chǎn)品的*方案以及更多的應用數(shù)據(jù)，敬請期待。細胞活性和基因調(diào)控檢測PierceLDHCytotoxicityAssayKit—簡單、可靠的比色檢測試劑盒,可用于細胞毒性的定量分析alamarBlueCellViabilityAssayReagent—快速

R&D Systems DuoSet® ELISA Kit 選購注意事項2013/03/19

一、什么樣的客戶適合選用DuoSetELISA?主要為客戶篩選高通量的指標而設計的，適合熟悉ELISA研發(fā)的實驗人員使用。沒有ELISA經(jīng)驗，進行ELISA檢測的客戶不建議使用。二、DuoSetELISAKit里面一共有多少塊板子？1個DuoSet試劑盒包含的試劑可以滿足大約15塊96孔微孔板的檢測。三、DuoSetELISAKit檢測的樣本類型是什么？檢測樣本類型：細胞培養(yǎng)的上清液熟悉ELISA研發(fā)的實驗人員已成功將其推廣到血清和血漿樣本的使用。如果要決定試劑盒是否可用于組織勻漿（或其它未經(jīng)檢

磁珠式菌種保藏管使用方法2013/03/19

我公司代理加拿大PULSE的菌種保藏管產(chǎn)品。其使用方法圖示如下：