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DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：原位雜交實(shí)驗(yàn)要求及步驟22013/08/06: 三、操作步驟（一）取材、冰凍切片：將動(dòng)物以3%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，暴露心臟，刺破右心耳，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動(dòng)物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（見圖2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1MPBS浸泡沖洗4-5次（換液：1次/hr）。將組織塊入30%蔗糖/0.1MPBS液（4℃），1-2天后冰凍切片，將切片裱貼于原位雜交玻片上，切片厚度為15-20μm。（二）探針制備與檢測（定量）：1.隨機(jī)引物制備cDNA核酸探針以DIGDNA標(biāo)記檢測試劑盒

DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：原位雜交實(shí)驗(yàn)要求及步驟12013/08/06: 原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)（InsituHybridizationHistochemistry，ISHH）簡稱原位雜交（InSituHybridization），屬于固相分子雜交的范疇，它是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法。根據(jù)所用探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。根據(jù)探針的標(biāo)記物是否直接被檢測，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標(biāo)記的探針與靶核酸進(jìn)行雜交，

DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：限制性內(nèi)切酶消化DNA實(shí)驗(yàn)2013/07/27: 標(biāo)簽：限制性內(nèi)切酶消化DNA影響限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的因素很多。DNA制品中的污染均能抑制酶切活性。這種抑制可通過增加酶作用單位數(shù)、增大反應(yīng)體枳以稀釋可能的抑制劑或延長反應(yīng)時(shí)間來加以克服。實(shí)驗(yàn)方法單酶單DNA樣品消化消化多個(gè)DNA部分消化實(shí)驗(yàn)方法原理進(jìn)行限制酶切割反應(yīng)只需簡單地將酶和DNA樣品放在合適的反應(yīng)緩沖液溫育，其中DNA和酶的量、緩沖液的離子強(qiáng)度、溫育溫度和時(shí)間都依具體的反應(yīng)而改變。實(shí)驗(yàn)材料DNA試劑、試劑盒TE酶切緩沖液EDTA儀器、耗材電泳儀實(shí)驗(yàn)步驟1.混合下列溶液于一個(gè)無菌的微量離心管

DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：DNA斑點(diǎn)和狹線印跡實(shí)驗(yàn)2013/07/27: 斑點(diǎn)和狹線印跡是一種將混合的未經(jīng)分離的面定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上進(jìn)行雜交分析的簡單技術(shù)。用來檢測被印跡的1DNA制品中靶序列的相對(duì)豐度。實(shí)驗(yàn)方法多樣抽濾法實(shí)驗(yàn)材料DNA試劑、試劑盒SSCNaClNaOHTris·Cl儀器、耗材紫外透射儀電泳儀多樣抽濾加樣器實(shí)驗(yàn)步驟1.裁一張與多樣過濾加樣器一樣大小的尼龍膜，將膜置于6×SSC的表面讓其自然浸沒。放置10min。2.裁一張與多樣過濾加樣器一樣大小的Whatman3MM濾紙，用6×SSC浸濕。3.將Whatman3MM濾紙置于多樣抽濾加樣器上，將膜

DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化及篩選2013/07/27: *節(jié)概述質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。如果要克隆較小的DNA片段（＜10kb）且結(jié)構(gòu)簡單,質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段,然后體外使兩者相連接,再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌,即可完成。但在實(shí)際工作中,如何區(qū)分插入有外源DNA的重組質(zhì)粒和無插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過調(diào)整連接反應(yīng)中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進(jìn)一步采取一些特殊的克隆策略,如

DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：DNA的酶切實(shí)驗(yàn)2013/07/27: 采用粘末端連接必須對(duì)目的DNA分子和載體分子進(jìn)行酶切以獲得相應(yīng)的粘末端進(jìn)行連接。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單，但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應(yīng)溫度不同，這時(shí)可以采用如下措施解決：1）先用一種酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切；2）先進(jìn)行低鹽要求的酶酶切，然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應(yīng)要求，加入第二種酶進(jìn)行酶切；3）使用通用緩沖液進(jìn)行雙酶切。具體要根據(jù)酶的反應(yīng)要求進(jìn)行，盡量避免星號(hào)活力。一材料、試劑和儀器：1材料：質(zhì)粒DNA

DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：亞硫酸氫鹽修飾后測序法檢測甲基化2013/07/27: 甲基化檢測方法（亞硫酸氫鹽修飾后測序法）甲基化是目前的研究熱點(diǎn)，就我所做的一點(diǎn)工作并其中一點(diǎn)心得，與大家分享。希望能夠?qū)Υ蠹矣兴鶐椭?部分基因組DNA的提取。這一步?jīng)]有懸念，*可以購買供細(xì)胞或組織使用的DNA提取試劑盒，如果實(shí)驗(yàn)室條件成熟，自己配試劑提取*可以。DNA比較穩(wěn)定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因組DNA應(yīng)該是完整的。此步重點(diǎn)在于DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。使用兩者的細(xì)節(jié)：1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水

DNA專題：從動(dòng)物肝臟中提取DNA2013/07/22: 一、原理：在濃氯化鈉（1―2mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小，在稀氯化鈉（0.14mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來。將抽提得的核蛋白用SDS（十二烷基硫酸鈉）處理，DNA或（RNA）即與蛋白質(zhì)分開，可用氯仿―異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA則溶解于溶液中。向溶液中加入適量乙醇，DNA即析出。為了防止DNA或（RNA）酶解，提取時(shí)加入EDT

染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)2013/07/22: （二）、除雜及抗體哺育。8、超聲破碎結(jié)束后，10，000g4oC離心10min。去除不溶物質(zhì)。留取300ul做實(shí)驗(yàn)，其余保存于-80oC。300ul中，100ul加抗體做為實(shí)驗(yàn)組；100ul不加抗體做為對(duì)照組；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl終濃度為0.2M），65oC處理3h解交聯(lián)，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。9、在100ul的超聲破碎產(chǎn)物中，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpe

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）（圖）2013/07/22: 實(shí)驗(yàn)原理熒光原位雜交（FluorescenceinsituhybridizationFISH）是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域。FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DN

凝膠遷移實(shí)驗(yàn)系列二-實(shí)驗(yàn)操作方法2013/07/22: 1.探針的標(biāo)記：（1）如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：待標(biāo)記探針（1.75pmol/微升）2微升T4PolynucleotideKinaseBuffer（10X）1微升Nuclease-FreeWater5微升[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmolat10mCi/ml）1微升T4PolynucleotideKinase（5-10U/微升）1微升總體積10微升按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4PolynucleotideKinase，混勻。（2）使用水

DNA專題：大腸桿菌細(xì)菌轉(zhuǎn)化2013/07/22: 一、原理質(zhì)粒DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)過42°C短時(shí)間的熱擊處理，促進(jìn)吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達(dá)，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長。二、器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯?，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作臺(tái)，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱。三、試劑培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），無菌ddH2O,IPTG,X-gal.四、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備無菌dd

DNA專題：質(zhì)粒DNA的提取與純化2013/07/22: 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，進(jìn)行遺傳工程改良物種等工作時(shí)zui主要的DNA載體。提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步：①細(xì)菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增②細(xì)菌菌體的裂解③質(zhì)粒DNA的純化本實(shí)驗(yàn)采取的菌體裂解方法為堿解法，質(zhì)粒純化方法為梯度離心法。二、材料與試劑1、材料：大腸桿菌2、儀器：超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)箱，搖床，恒溫水浴鍋，臺(tái)式離心機(jī)，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機(jī)，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測儀3、

ATCC:食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法2013/07/15: 1主題內(nèi)容與適用范圍本文規(guī)定了食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法。本文適用于航空食品的檢驗(yàn)。2設(shè)備和材料吸管（1ml、10ml）、恒溫培養(yǎng)箱（36±1℃、44.5±0.5℃）、冰箱、均質(zhì)器、振蕩器、平皿、稀釋瓶、天平、顯微鏡等3培養(yǎng)基和試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白月示（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、EC肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、營養(yǎng)瓊脂斜面、色氨酸肉湯、MR-PV培養(yǎng)基、Korser氏枸掾酸鹽肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液、

ATCC專題：實(shí)驗(yàn)室消毒滅菌技術(shù)2013/07/15: 嚴(yán)格的消毒滅菌對(duì)細(xì)胞與胚胎工程研究與應(yīng)用工作極為重要，直接影響著整個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊耥樌M(jìn)行。（一）消毒滅菌方法目前常用的消毒滅菌方法多采用物理方法（如干熱滅菌法、濕熱滅菌法、過濾除菌法、射線殺菌法等）和化學(xué)方法（消毒劑、抗生素）兩大類。1．干熱滅菌法是利用恒溫干燥箱內(nèi)120oC～150oC的高熱，并保持90～120分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的的一種方法。主要適用于不便在壓力蒸汽滅菌器中進(jìn)行滅菌，且不易被高溫?fù)p壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能和蒸汽接觸的物品的滅菌。用此方法滅菌的物品干燥，易于貯存。

ATCC專題：細(xì)菌凍存方法2013/07/15: 實(shí)驗(yàn)試劑BacteriumpreparationCryoprotectiveagentTrueCoolTMcryovial實(shí)驗(yàn)設(shè)備CoolBoxTMCFT30ice-freecoolingstationCoolRack®CFT30CoolRack®CFCryolabelsand/orcryomarkersThermalTrayHPplatform（optional）CoolSinkTMBX50（optional）37°Cwaterbath-80°CFreezer實(shí)驗(yàn)步驟1.BacteriaPre

ATCC專題：實(shí)驗(yàn)室無菌操作2013/07/15: （一）無菌操作前的準(zhǔn)備工作培養(yǎng)材料接種時(shí)的無菌操作過程除上述各項(xiàng)消毒滅菌操作外，還需完成以下無菌操作步驟，從而獲得接種的無菌培養(yǎng)材料。工作人員無菌操作前需用肥皂刷洗雙手及手臂，并用流水沖凈，并對(duì)手臂消毒后穿戴好滅菌工作服、工作帽和口罩，更換拖鞋，才能進(jìn)入無菌操作區(qū)。如進(jìn)入層流操作室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，應(yīng)完成緩沖準(zhǔn)備區(qū)內(nèi)的淋浴、一次更換滅菌衣帽、拖鞋；手臂消毒、二次更換滅菌防護(hù)衣帽、手套、拖鞋等；再在風(fēng)淋區(qū)進(jìn)行無菌風(fēng)淋后方可進(jìn)入層流操作室。進(jìn)入無菌操作區(qū)后，再用70%～75%的酒精擦拭雙手和前臂，完成無

ATCC專題：食品中菌落總數(shù)的測定2013/07/15: 食品中菌落總數(shù)的測定，目的在于了解食品在生產(chǎn)中，從原料加工到成品包裝受外界污染的情況；也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)，確定食品的保存期，以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。食品有可能被多種類群的微生物所污染，每種細(xì)菌都有它一定的生理特性，培養(yǎng)時(shí)應(yīng)用不同的營養(yǎng)條件及其生理?xiàng)l件（如溫度、培養(yǎng)時(shí)間、PH值、需氧性質(zhì)等）去滿足其要求，才能分別將各種細(xì)菌培養(yǎng)出來。但在實(shí)際工作中，一般都只用一種常用的方法去作菌落總數(shù)的測定，所得結(jié)果，只包括一群能在營養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫性需氧菌的菌落數(shù)。國

專題：細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作方法2013/07/08: 轉(zhuǎn)染，是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實(shí)驗(yàn)室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因?qū)爰?xì)胞的范例；化學(xué)介導(dǎo)方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)；生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率zui

專題：轉(zhuǎn)染（transfection）--轉(zhuǎn)染試劑的選擇2013/07/08: 下面我們?yōu)榇蠹姨峁┮恍┏Ｓ弥|(zhì)體試劑的適用細(xì)胞系信息以及轉(zhuǎn)染FAQs：1.promega公司Promega轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品適合于人HeLa，HepG2，293，K562，Jurkat；猴COS-7，CV-1；小鼠NIH3T3；倉鼠BHK，CHO；大鼠PC12；昆蟲S19等等細(xì)胞系的RNAi轉(zhuǎn)染。詳情請(qǐng)參閱http：//www.promega.com.cn/files/cpxl/zhuanran/zhuanran.htm2.Invitrogen公司根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，我公司推薦您使用Invitrogen公司生產(chǎn)

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