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專題：瞬時轉(zhuǎn)染分析研究的步驟2013/07/08: 1．瞬時轉(zhuǎn)染分析法目前有很多功能性分析方法用于研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控，zui常用的方法是瞬時轉(zhuǎn)染分析法。該方法是通過一定的轉(zhuǎn)染程序?qū)⒑康恼{(diào)控區(qū)的質(zhì)粒導(dǎo)人培養(yǎng)細(xì)胞。在典型情況下，調(diào)控區(qū)調(diào)控“報告基因”的轉(zhuǎn)錄。報告基因是在mRNA和蛋白質(zhì)的水平上都易于被正確檢測到的基因。產(chǎn)生的質(zhì)粒在培養(yǎng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄后，在特定時刻測定從報告基因上合成的mRNA或蛋白質(zhì)，以評價調(diào)控區(qū)的活性。人們將這種分析方法稱為瞬時轉(zhuǎn)染分析，因為此時質(zhì)粒仍然以附加的形式存在，很少整合進宿主基因組。因此，mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物必須在短時間內(nèi)（1～3

專題：轉(zhuǎn)染實驗的注意事項2013/07/08: 將制備好的siRNA，siRNA表達載體或表達框架轉(zhuǎn)導(dǎo)至真核細(xì)胞中的方法主要有以下幾種：1.磷酸鈣共沉淀將氯化鈣，RNA（或DNA）和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過胞飲進入目的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因為甚至偏離*條件十分之一個pH都會導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。2.電穿孔法電穿孔通過將細(xì)胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。將細(xì)胞懸浮液置于電場中會

專題:脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染法2013/07/08: 脂質(zhì)體（lipofectinregeant,LR）試劑是陽離子脂質(zhì)體N-[1-2，3-Dioleyoxy,Propyl]-n,n,n-TrimethylammoniumChloride（DOTMA）和Dioleoylphotidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1:1（w/w）]。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下zui方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。用LR進行轉(zhuǎn)染時，首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找

ELISPOT技術(shù)的應(yīng)用與展望2013/06/30: ELISPOT技術(shù)的*優(yōu)點已經(jīng)讓它在抗原特異性T細(xì)胞免疫學(xué)研究上*。它是當(dāng)今*能夠檢測到到百萬分之一陽性細(xì)胞率的檢測技術(shù)。如此高的靈敏度就連流式細(xì)胞技術(shù)（細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色）和tetramer技術(shù)也*（LetschAet.al.，2003）。此外由于淋巴細(xì)胞的凍存復(fù)蘇問題也得到了的解決，經(jīng)過凍存復(fù)蘇的細(xì)胞并不喪失免疫功能（MaeckerHTet.al.，2005；KvarnstromMet.al.，2004）。這一點對臨床試驗非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的病人血樣。如果試驗牽

ELIspot常見問題分析與解決辦法2013/06/30

ELISPOT技術(shù)原理和技術(shù)特點2013/06/30: ELISPOT全名為酶聯(lián)免疫斑點檢測，英文：Enzyme-linkedImmunospotAssay。它結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA技術(shù)），能夠在單細(xì)胞水平檢測細(xì)胞因子的分泌情況。其技術(shù)原理，一句話概括就是：用抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點顯色的方式將其表現(xiàn)出來（SedgwickJD2005）。該技術(shù)檢測細(xì)胞因子具有三大優(yōu)點：其一，靈敏度高。在一百萬個陰性細(xì)胞中只要有一個分泌細(xì)胞因子的陽性細(xì)胞即可被檢測出來。這是目前為止，zui為靈敏的檢測技術(shù)，靈敏度比傳

運用流式細(xì)胞儀計數(shù)細(xì)胞應(yīng)注意的問題2013/06/30: 運用流式細(xì)胞儀計數(shù)細(xì)胞應(yīng)注意的問題制作組織勻漿或細(xì)胞懸液，用熒光染料染色，則可以用流式細(xì)胞儀計數(shù)不同DNA含量或倍數(shù)的細(xì)胞數(shù)。例如，在睪丸組織中，精子細(xì)胞為單倍體細(xì)胞，精原細(xì)胞、Sertoli細(xì)胞、Leydig細(xì)胞和其他非生精細(xì)胞為雙倍體細(xì)胞，初級精母細(xì)胞以及處于分裂期的精原細(xì)胞和非生精細(xì)胞為四倍體細(xì)胞。因此，運用流式細(xì)胞儀測定睪丸組織各級生精細(xì)胞DNA倍體的變化，可以間接判斷不同生精細(xì)胞數(shù)目相對比例變化的趨勢。但是，利用這些結(jié)果得出結(jié)論時一定要謹(jǐn)慎。例如，單倍體細(xì)胞數(shù)所占百分比下降可能說明精子

流式細(xì)胞儀的工作原理2013/06/30: 流式細(xì)胞儀的工作原理流式細(xì)胞儀主要由四部分組成：流動室和液流系統(tǒng)，激光源和光學(xué)系統(tǒng)，光電管和檢測系統(tǒng)，計算機和分析系統(tǒng)。四大系統(tǒng)共同完成信號的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和傳輸任務(wù)。檢測時將待測細(xì)胞或微粒制成細(xì)胞懸液，進行熒光染色后加入樣品管中。以一定壓力將待測樣品壓人流動室，在高壓下磷酸緩沖液（鞘液）從鞘液管噴出，鞘液管人口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形流束（鞘流），待測細(xì)胞在鞘液包繞下單行排列，依次通過檢測區(qū)。流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦后的光束，垂直

細(xì)胞培養(yǎng)小技巧---操縱時間的藝術(shù)2013/06/16: 眾所周之，每次給細(xì)胞換液體的時候都需要把細(xì)胞拿出來，然而就這一拿，“學(xué)問”就在里面：我們要盡量縮短細(xì)胞在培養(yǎng)箱外面的時間，盡量增加細(xì)胞在zui適環(huán)境中的時間。換液流程：1.將培養(yǎng)基放在37度水浴鍋內(nèi)，準(zhǔn)備好廢液缸、吸管、酒精棉球，干棉球，在超凈臺上，將照相機放在顯微鏡旁邊，然后開超靜臺紫外，開培養(yǎng)室紫外，開培養(yǎng)室風(fēng)機，空調(diào)。2.30min后，進培養(yǎng)室。3.關(guān)紫外，開超凈臺風(fēng)機，酒精擦手，關(guān)水浴鍋，將水浴鍋內(nèi)的培養(yǎng)基放在超凈臺上，用干棉球擦干，然后開蓋，準(zhǔn)備好吸管。4.這個時候再從培養(yǎng)箱里將培養(yǎng)瓶

細(xì)胞培養(yǎng)之無菌技術(shù)注意事項匯總2013/06/16: 簡介細(xì)胞培養(yǎng)的成功很大程度上取決于保護細(xì)胞免受細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染。非無菌物品、培養(yǎng)基和試劑、帶有微生物的空氣顆粒、不干凈的培養(yǎng)箱和污染的工作臺面均是導(dǎo)致微生物污染的來源。無菌技術(shù)的作用是在環(huán)境微生物與無菌的細(xì)胞培養(yǎng)物之間形成一道屏障，它通過一套操作流程來降低培養(yǎng)物被上述污染源污染的可能。無菌技術(shù)的組成要素包括：無菌工作區(qū)域、良好的個人衛(wèi)生、無菌試劑和培養(yǎng)基以及無菌操作。無菌工作區(qū)域zui為簡單、經(jīng)濟的減少空氣顆粒和氣體揮發(fā)（例如：灰塵、芽孢、皮屑、噴嚏）污染的方法就是采用細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)

體外細(xì)胞的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇2013/06/16: 一、實驗原理細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。直接從體內(nèi)獲取的組織細(xì)胞進行培養(yǎng)為原代培養(yǎng)；當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達到一定密度后，則需要做再培養(yǎng)，即將培養(yǎng)的細(xì)胞分散后，從一個容器以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個或幾個容器中擴大培養(yǎng)，為傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細(xì)胞的代數(shù)。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以zui大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或DMSO作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少

細(xì)胞凋亡實驗步驟及注意事項2013/06/16: 一、實驗?zāi)康?、掌屋凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征2、學(xué)會用熒光探針對細(xì)胞進行雙標(biāo)記來檢測正?；罴?xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的方法二、實驗原理細(xì)胞死亡根據(jù)其性質(zhì)、起源及生物學(xué)意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個體和生存中起著非常重要的作用。它是細(xì)胞在一定生理條件下一系列順序發(fā)生事件的組合，是細(xì)胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過程。細(xì)胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。在形態(tài)上可見凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞脫離接觸，細(xì)胞變園，細(xì)胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、細(xì)胞核固縮破裂呈團塊狀

微生物液體培養(yǎng)基移種技術(shù)2013/05/26: 用于純種細(xì)菌的增菌及觀察細(xì)菌在液體環(huán)境中的生長特征（混濁生長，表面生長或沉淀生長）（1）材料肉湯培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物（大腸埃希菌、化膿性鏈球菌、枯草芽胞桿菌）（2）方法①取接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌、冷卻。②以“雙管移植法”左手持細(xì)菌斜面培養(yǎng)物和肉湯培養(yǎng)基兩支試管，右手持接種環(huán)，按無菌操作法取少量細(xì)菌，將沾菌的接種環(huán)在斜傾的接近液面的管壁上輕輕涂抹研勻，試管直立使沾附在管壁上的細(xì)菌沒入液體中，接種后放37℃恒溫箱中培養(yǎng)。（3）結(jié)果①渾濁生長大腸埃希菌菌液呈均勻混濁，管底有少量沉淀。②沉淀生長化膿性鏈球菌

微生物水體中大腸菌群的檢測2013/05/26: 實驗原理所謂大腸菌群，是指在37℃培養(yǎng)24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革藍(lán)氏陰性無芽孢桿菌的總稱。主要由腸桿菌科中四個屬內(nèi)的細(xì)菌組成，即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。水的大腸菌群數(shù)是指100mL水檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實際數(shù)值，以大腸菌群zui近似數(shù)（MPN）表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽孢桿菌等多種細(xì)菌。這些細(xì)菌都可以隨人畜排泄物進入水源，由于大腸菌群在腸道內(nèi)數(shù)量多，所以，水源中大腸菌群的數(shù)量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項重要指標(biāo)

微生物細(xì)菌凍存方法2013/05/26: 實驗試劑BacteriumpreparationCryoprotectiveagentTrueCoolTMcryovial實驗設(shè)備CoolBoxTMCFT30ice-freecoolingstationCoolRack®CFT30CoolRack®CFCryolabelsand/orcryomarkersThermalTrayHPplatform（optional）CoolSinkTMBX50（optional）37°Cwaterbath-80°CFreezer實驗步驟1.BacteriaPre

微生物半固體培養(yǎng)基移種技術(shù)2013/05/26: 用于保存菌種及間接檢查細(xì)菌有無動力。（1）材料半固體培養(yǎng)基。細(xì)菌斜面培養(yǎng)物。（2）方法①將接種針經(jīng)火焰滅菌冷卻后，從斜面培養(yǎng)物表面沾取細(xì)菌。②用無菌法穿刺接種，將接種針刺入半固體培養(yǎng)基正中央，深度達距管底0.5cm處停止，然后循原路退出。注意在刺入及拔出時要保持接種針不向穿刺線外擺動。③試管口通過火焰滅菌，塞上棉塞。接種針經(jīng)火焰滅菌。培養(yǎng)物放37℃恒溫箱中培養(yǎng)。（3）結(jié)果：有動力的細(xì)菌呈擴散生長，無動力的細(xì)菌沿穿刺線生長。

微生物斜面培養(yǎng)基移種技術(shù)2013/05/26: （1）材料瓊脂斜面培養(yǎng)基經(jīng)分離培養(yǎng)的平板培養(yǎng)物。（2）方法①在瓊脂斜面培養(yǎng)基試管上部標(biāo)明移種的菌名（或編號）、接種日期、接種者的組別及代號。②左手持長有細(xì)菌的平板底，右手持接種環(huán)。接種環(huán)在火焰上滅菌冷卻后，沾取平板劃線上發(fā)育良好的孤立菌落。把平板放回原處，立即用此手取斜面培養(yǎng)基斜持，用右手小指與手掌夾持棉塞，輕輕轉(zhuǎn)動后撥出棉塞，管口通過火焰滅菌。③將已沾菌的接種環(huán)伸入斜面培養(yǎng)基的管底部的凝固水，沿斜面培養(yǎng)基的表面從底向上劃一直線，然后再從底部向上劃連續(xù)曲折線；也可不劃直線只劃曲折線。取出接種環(huán)，

【感受態(tài)細(xì)胞的制備】一步法制備感受態(tài)細(xì)胞2013/05/15: 一、操作步驟：1.涂平板：為取得*的感受態(tài)效率，必須先把甘油菌或其它形式保存的菌種涂LB平板，并培養(yǎng)過夜。2.接種：取一有新鮮培養(yǎng)的菌種的LB平板，后續(xù)操作均在超凈臺內(nèi)進行。把鑷子的頂端在70%酒精中蘸一下，并在酒精燈上略略燒一下，使鑷子的頂端處于無菌狀態(tài)。用鑷子夾取一個無菌的塑料槍頭或牙簽，從平板上挑取一個單克隆，然后把蘸有菌種的塑料槍頭或牙簽放到裝有3毫升LB的細(xì)菌培養(yǎng)試管內(nèi)。上述操作也可以使用接種環(huán)等進行操作。3.培養(yǎng)：37℃約200rpm培養(yǎng)過夜，通常培養(yǎng)時間控制在16小時左右為宜。不宜

感受態(tài)細(xì)胞的制備】感受態(tài)細(xì)胞的制備及溶液配制2013/05/15: 1.挑取適當(dāng)菌株的E.coli單菌落接種于2mlSOB培養(yǎng)液中，37℃搖床過夜。2.取0.5-1ml過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)種到50mlSOB中，18℃劇烈震蕩，直到A600達到0.6。3.將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，4℃4,000rpm/min離心10min。同時在冰浴上配置TB溶液。4.棄上清，將離心管倒置于濾紙上，使培養(yǎng)液被吸干。5.取1ml剛配的TB溶液打散菌體沉淀，再加入15mlTB（1/3體積的起始培養(yǎng)液），冰浴10-15min，4℃4,000rpm/min離心10min。6.棄上清，沉

【感受態(tài)細(xì)胞的制備】如何選擇進口高壓滅菌器2013/05/15: 進口高壓滅菌器因其使用的安全性和自動化程序高，深受實驗室用戶的喜愛。那么，怎么才能買到稱心如意的產(chǎn)品呢？怎樣區(qū)分哪些產(chǎn)品是*？哪些是國內(nèi)組裝產(chǎn)品呢？下面將告訴您如何選擇進口高壓滅菌器：在選購進口高壓滅菌器之前，首先需要了解，進口高壓滅菌器，尤其是50升以上的進口高壓滅菌器，在中國屬于特種設(shè)備，在使用前，用戶需要向當(dāng)?shù)氐奶胤N設(shè)備檢查機構(gòu)（或是鍋檢所，或是技術(shù)監(jiān)督局，按各地的實際情況）辦理使用許可證。在申請辦理使用許可證時，需要提交的證書包括：一、《進口壓力容器生產(chǎn)許可證》，簡稱壓力容器許可證。這個

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