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RNA實(shí)驗技術(shù)：RNA的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗原理和步驟2013/10/12: 一、實(shí)驗?zāi)康恼莆罩参锟俁NA非變性膠電泳的原理和方法。二、實(shí)驗原理RNA電泳可以在變性及非變性兩種條件下進(jìn)行。非變性電泳使用1.0%--1.4%的凝膠，不同的RNA條帶也能分開，但無法判斷其分子量。只有在*變性的條件下，RNA的泳動率才與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。因此要測定RNA分子量時，一定要用變性凝膠。在需快速檢測所提總RNA樣品完整性時，配制普通的1%瓊脂糖凝膠即可。三、實(shí)驗材料、器具及藥品蘑菇的總RNA溶液。電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測儀等。瓊脂糖，1XTA

RNA實(shí)驗技術(shù)：肝臟細(xì)胞RNA的提取2013/10/12: 一．原理RNA提取技術(shù)不僅是分子生物學(xué)技術(shù)的重要組成部分，也是功能基因組學(xué)科研技術(shù)的重要基礎(chǔ)。從RNA水平研究生物體內(nèi)基因的調(diào)控機(jī)制，已成為分子生物學(xué)研究的一個重要手段。對某一生物或組織進(jìn)行性狀研究，首先要獲得該性狀基因，從組織細(xì)胞中分離完整的RNA對于分子克隆和基因表達(dá)分析等實(shí)驗是至關(guān)重要的，如Northern印跡及雜交分析、cDNA合成等實(shí)驗的成效在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。利用提取的RNA人們可以對特定的基因表達(dá)進(jìn)行定量的檢測，從分子水平的了解細(xì)胞生命活動的規(guī)律。通常一個典型的哺乳動物

RNA實(shí)驗技術(shù)：RNAi表達(dá)載體構(gòu)建2013/10/12: 近年來的研究表明,一些短片斷的雙鏈RNA可以通過促使特定基因的mRNA降解來、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá),誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型,稱為RNA干擾（RNAinterference,RNAi）.siRNA（smallinterferingRNAs）就是這種短片斷雙鏈RNA分子,能夠以序列同源互補(bǔ)的mRNA為靶目標(biāo),降解特定的mRNA.RNAi的發(fā)現(xiàn)具有劃時代的意義,它不僅深入揭示了細(xì)胞內(nèi)基因沉默的機(jī)制,而且它還是后基因組時代基因功能分析的有力工具,極大地促進(jìn)了人類揭示生命奧秘的進(jìn)程.現(xiàn)在越

RNA實(shí)驗技術(shù)：總RNA的提取2013/10/12: 完整RNA的提取和純化，是進(jìn)行RNA方面的研究工作，如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個關(guān)鍵點(diǎn)，即１）：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；２），有效地使核蛋白復(fù)合體變性；３），對內(nèi)源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；5），對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中zui關(guān)鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑，1），提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀

RNA實(shí)驗技術(shù)：TRIzol RNA提取方法2013/10/12: TRIzolRNA提取試劑盒是由GIBCOBRL公司推出提取RNA的產(chǎn)品，其操作方便、快捷。在TRIzol中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對樣品的后續(xù)操作會要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時。塑料器皿可以在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，用水*漂洗干凈后高壓滅菌備用。（一）試劑準(zhǔn)備1．TRIzol試劑。2．氯仿3．異丙醇4．75%乙醇（DEPCH2O配制）5．DEPCH2O（二）操作步驟1．樣品處理：（1）培養(yǎng)細(xì)胞：收獲細(xì)胞1-5×

DNA實(shí)驗技術(shù)：質(zhì)粒DNA限制性酶切圖譜分析2013/10/12: 一、DNA的限制性酶切實(shí)驗原理核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等功物的免疫系統(tǒng)，用于抗擊外來ＤＮＡ的侵襲。限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的ＤＮＡ段５’端為Ｐ，３’端為ＯＨ。1.限制性內(nèi)切酶的類型根據(jù)限制酶的識別切割特性，催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。*類（I型）限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，它們在識別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割DNA鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨

【DNA含量測定】測序通用引物2013/09/04: 相關(guān)專題引物設(shè)計載體名稱上游引物（5'primer）下游引物（3'primer）P3*FLAG-CMVCMV-30（825-854）CMV-24（1129-1152）pAc5.1/V5-His（_A,_B,_C）pAc5-5BGHrevpAcG2TpGEX-5notavailablepACTT7EEVT3/EBVrevpACT2GAL4ADforpGAL4-ADrvpACT2p17110p12584pACYC184（BamHI-site）PBRforBamPBRrevBampAC

【DNA原位雜交技術(shù)】熒光原位雜交（FISH）探針的制備及其應(yīng)用2013/09/04: zui近有一些戰(zhàn)友對熒光原位雜交技術(shù)比較感興趣，我整理了相關(guān)資料和自己的心得，和大家交流一下。不妥之處，請大家指出，共同討論學(xué)習(xí)。內(nèi)容分三部分：一、概述1.克隆性染色體異常是腫瘤的特征2.染色體異常常見的類型3.染色體異常的檢測方法二、熒光原位雜交及其探針1.熒光原位雜交的原理2.熒光原位雜交的探針三、熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交（按試驗流程介紹）一、概述1.克隆性染色體異常是腫瘤的特征1914年德國遺傳學(xué)家Boveri就提出染色體畸變與腫瘤起源相關(guān)，然而這還僅僅只是一個假說；1960年

動物實(shí)驗基礎(chǔ)知識系列：飼料、飲水及飼養(yǎng)環(huán)境2013/09/04: 做動物實(shí)驗，zui先要做的事情就是要養(yǎng)好動物。掌握好動物飼料、飲水及其生活環(huán)境，這對于動物實(shí)驗的成功是zui基本的保證。這是看似一個平常，但卻有著不少細(xì)節(jié)的問題。為了本版廣大站友能在整體上提高對實(shí)驗動物飼養(yǎng)的認(rèn)識，做好動物實(shí)驗的*步，特此開設(shè)本貼討論動物飼養(yǎng)的問題。希望大家能踴躍參與，以更多的實(shí)例來充實(shí)、豐富本貼。擬分以下幾個方面來討論：實(shí)驗動物的選擇概述實(shí)驗動物如何辨雌雄實(shí)驗動物的適應(yīng)性飼養(yǎng)實(shí)驗動物的飼料（普通飼料、特殊飼料）實(shí)驗動物的飲水實(shí)驗動物的籠具實(shí)驗動物的墊料實(shí)驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境實(shí)驗動物

DNA實(shí)驗技術(shù)：變性聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗2013/08/22: 標(biāo)簽：變性聚丙烯酰胺凝膠電泳本方法由于快捷、簡便及具髙分離度，對純化寡核苷酸非常有用。盡管得到率偏低（＜50%），回收的量通常卻大大超過了大多數(shù)分子生物學(xué)應(yīng)用所需的量步驟亦可用于分離小RNA或其他單鏈多聚核苷酸。實(shí)驗方法基本方法實(shí)驗材料核苷酸試劑、試劑盒濃氨水TBE丙烯酰胺亞甲雙丙烯酰胺TEMED尿素過硫酸銨TE儀器、耗材真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀電泳儀實(shí)驗步驟1.用濃氨水將合成的寡核苷脧從可控孔度玻璃拄上洗脫下來。于55℃加熱5h以上。2.樣品移至離心管中，在Speedvac真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中凍干，沉淀用0

DNA實(shí)驗技術(shù)：DNA印跡雜交分析實(shí)驗2013/08/22: 標(biāo)簽：DNA印跡雜交雜交分析的原理是特定序列的單鏈DNA分子（即通常標(biāo)記的“探計”）可與另一個固定了的具有互補(bǔ)序列（“靶”序列）的DNA分子或RNA分子形成堿基配對，雜交分子的穩(wěn)定性取決于發(fā)生堿基配對的程度，這一技術(shù)可檢測復(fù)雜基因組中的單拷貝基因。實(shí)驗方法放射標(biāo)記法實(shí)驗方法原理本方案適合于用100~1000bp長的放射性標(biāo)記的DNA探針對Southern轉(zhuǎn)印、斑點(diǎn)及狹線印跡進(jìn)行雜交分析。實(shí)驗材料DNA試劑、試劑盒SDSSSC儀器、耗材水浴鍋培養(yǎng)箱實(shí)驗步驟1.用6×SSC潤濕帶有固定了的DNA的膜

DNA實(shí)驗技術(shù)：Southern 印跡實(shí)驗2013/08/22: 標(biāo)簽：Southern印跡Southern印跡法是將DNA段從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移至膜支持物上，使DNA段固定，因此該膜半*性地重現(xiàn)出凝膠電泳的帶型。實(shí)驗方法印跡法堿性緩沖液法向下毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)印法實(shí)驗方法原理本方案是專門為將瓊脂糖凝膠印跡至不帶電荷或帶正電荷的尼龍膜上而設(shè)計的，稍作修改后同樣可用于硝酸纖維素膜方法。實(shí)驗材料DNA試劑、試劑盒HClNaClTrisNaOHSSC溴化乙錠儀器、耗材電泳儀紫外透射儀實(shí)驗步驟一、向上毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法的轉(zhuǎn)移疊層系統(tǒng)：圖一、向上毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法的轉(zhuǎn)移疊層系統(tǒng)，A表示海

DNA實(shí)驗技術(shù)：脈沖場凝膠電泳實(shí)驗2013/08/22: 標(biāo)簽：脈沖場凝膠脈沖場凝膠電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進(jìn)行的，可分離長至5Mb的DNA分子，其工作原理是DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時間取決于它的大小。較小的分子重新定向較快，因而在凝膠中移動也較快，于是不同大小的分子被成功分離。實(shí)驗方法倒轉(zhuǎn)電場實(shí)驗材料DNA試劑、試劑盒GTBETBE瓊脂糖儀器、耗材電泳儀實(shí)驗步驟1.制備用于水平電泳的1%瓊脂糖凝膠，放入電泳裝置，其上覆蓋以2~3mm的GTBE或TBE緩沖液。2.加入液體樣品。裝好蠕動泵用于電泳緩沖液循環(huán)。3.對于微型

DNA實(shí)驗技術(shù)：細(xì)菌中制備基因組DNA實(shí)驗2013/08/22: 標(biāo)簽：細(xì)菌基因DNA真核生物的一切有核細(xì)胞（包括培養(yǎng)細(xì)胞）都能用來制備基因組DNA。真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，因此，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。實(shí)驗方法小量制備氯化銫法實(shí)驗方法原理提取DNA的一般過程是將分散好的組織細(xì)胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。實(shí)驗材料細(xì)菌試劑、試劑盒TE氯化銫溴化乙錠NaCl乙醇C

DNA實(shí)驗技術(shù)：植物組織制備基因組DNA實(shí)驗2013/08/22: 標(biāo)簽：植物組織基因DNA利用基因組DNA較長的特性，可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。在提取過程中，染色體會發(fā)生機(jī)械斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，因此分離基因組DNA時應(yīng)盡量在溫和的條件下操作，如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩，以保證得到較長的DNA。實(shí)驗方法氯化銫法CTAB法實(shí)驗方法原理加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)飄浮其中，可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部，從而達(dá)到提取的目的。實(shí)驗材料植物組織試劑、試劑盒抽提緩沖液

DNA實(shí)驗技術(shù)：哺乳動物中制備基因組DNA實(shí)驗2013/08/22: 標(biāo)簽：哺乳動物基因DNA在DNA提取過程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實(shí)驗打下基礎(chǔ)。一般真核細(xì)胞基因組DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養(yǎng)細(xì)胞或低溫保存的組織細(xì)胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細(xì)胞，隨后用酚抽提而實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗方法制備DNA實(shí)驗材料動物組織試劑、試劑盒PBS乙酸銨乙醇酚氯仿異戊醇TE儀器、耗材離心機(jī)搖床研缽實(shí)驗步驟1.切下組織并立即剪成小塊，置于液氮中凍結(jié)。2.將200mg~1g的組織用預(yù)冷的研缽和研

DNA實(shí)驗技術(shù)：大腸桿菌質(zhì)粒DNA 的提?。▔A裂解法）2013/08/22: 此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切PCR擴(kuò)增。1.取1.5ml細(xì)菌培養(yǎng)物于EP管中，4000rpm離心1分鐘，棄上清液，使細(xì)菌沉淀盡量干燥；2.將細(xì)菌沉淀重懸于用冰預(yù)冷的100μl溶液I（50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTApH8.0，25mmol/LTris-HClpH8.0）中，劇烈振蕩；3.加入200μl新配制的溶液II（0.2mol/LNaOH，1％SDS（m/v）），蓋緊EP管口，快速顛倒離心管5次，以混合混合物，確保離心管的整個內(nèi)表面與溶液II

DNA實(shí)驗技術(shù)：SSR標(biāo)記實(shí)驗步驟2013/08/06: 一、簡介：SSR簡單序列重復(fù)標(biāo)記（Simplesequencerepeat,簡稱SSR標(biāo)記），也叫微衛(wèi)星序列重復(fù)，是由一類由幾個核苷酸（1-5個）為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個核苷酸的重復(fù)序列，長度較短，廣泛分布在染色體上。由于重復(fù)單位的次數(shù)的不同或重復(fù)程度的不*相同，造成了SSR長度的高度變異性，由此而產(chǎn)生SSR標(biāo)記或SSLP標(biāo)記。雖然SSR在基因組上的位置不盡相同，但是其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以用微衛(wèi)星區(qū)域特定順序設(shè)計成對引物，通過PCR技術(shù)，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示SSR位

DNA實(shí)驗技術(shù)：凍融法回收DNA片段操作步驟2013/08/06: 1.紫外燈下仔細(xì)切下含待回收DNA的膠條，將切下的膠條（小于0.6g）搗碎，置于1.5ml離心管中；2.加入等體積的Tris-HCl飽和酚（pH7.6），振蕩混勻；3.-20℃放置5-10min；4.4℃離心10000g×5min，上層液轉(zhuǎn)移置另一離心管中；5.加入1/4體積H2O于含膠的離心管中，振蕩混勻；6.-20℃，放置5-10min；7.4℃離心10000g×5min，合并上清液；8.用等體積酚/氯仿、氯仿分別抽提一次，取上清；9.加入1/10體積3MNaAc（pH5.2）、2.5倍體積

DNA實(shí)驗技術(shù)，DNA 序列分析技術(shù)2013/08/06: 物種的遺傳多樣性在本質(zhì)上是DNA一級序列的多樣性。近年來，隨著DNA測序技術(shù)的迅速發(fā)展和日益普及，DNA測序在遺傳多樣性的研究中正在起著越來越大的作用。本章將介紹目前在遺傳多樣性研究中常用的一種手動和一種全自動雙鏈DNA測序方法。1DNA模板的制備在遺傳多樣性的研究中，由于樣本量一般都較龐大，因而DNA測序的速度就成了很關(guān)鍵的因素。因此，這類研究中常常直接測定純化的PCR雙鏈產(chǎn)物而不大采用克隆技術(shù)。本節(jié)介紹本實(shí)驗室常用的從PCR產(chǎn)物制備測序模板的方法，即低熔點(diǎn)膠回收法。（1）制備1.5％～2.0

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