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深圳市安培生物科技有限公司
中級會員 | 第5年
差異顯示PCR2021/12/21
材料與儀器反轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定DNA聚合酶錨定3'-寡核苷酸引物隨機(jī)5'-寡核苷酸引物總RNA帶放射標(biāo)記的dATP擴(kuò)增緩沖液DD-PCR反轉(zhuǎn)錄緩沖液DTTdNTP貯存液胎盤RNase抑制劑測序膠上樣緩沖液瓊脂糖凝膠電解質(zhì)梯度測序膠屏蔽型槍頭離心管正向排液式移液器PCR儀水浴箱步驟一、材料1.緩沖液與溶液10X擴(kuò)增緩沖液5XDD-PCR反轉(zhuǎn)錄緩沖液（250mmol/LTris-Cl（pH8.3），375mmol/LKCl，15mmol/LMgCl2）DTT(100mmol/L)4種dNTP貯存液（20m
cDNA 3'末端的快速擴(kuò)增（3’-RACE)2021/12/21
原理在用oligo(dT)引物構(gòu)建的cDNA文庫中，偶而發(fā)生部分cDNA克隆缺失了與靶mRNA3'末端互補(bǔ)的序列。這部分序列到底是在cDNA合成過程中還是在分子克隆中怎樣缺失和在哪個環(huán)節(jié)中缺失的尚不清楚。第一鏈cDNA的隨機(jī)斷裂，在合成第二鏈cDNA過程中DNA聚合酶不能抵達(dá)模板鏈的末端，引導(dǎo)序列內(nèi)部的poly(A)序列或在分子克隆過程中poly(dA:dT)序列附近的3'序列的缺失等都是可能造成3'末端序列缺失的原因。在用隨機(jī)六核苷酸引物構(gòu)建的cDNA基因文庫中，也存在部分的cDNA克隆缺失了
cDNA 5’末端的快速擴(kuò)增（5’-RACE）2021/12/21
原理在分子克隆中沒有比分離缺乏相應(yīng)的mRNA5'末端的序列特征結(jié)構(gòu)的cDNA克隆更易失敗的了。通常存在于cDNA基因文庫中的部分克隆，由于反轉(zhuǎn)錄酶未能沿全長mRNA模板延伸*，合成的cDNA第一條鏈往往5'末端不完整。材料與儀器反轉(zhuǎn)錄酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶緩沖液熱穩(wěn)定DNA聚合酶擴(kuò)增緩沖液氯仿dATPdNTP貯存液胎盤RNase抑制劑TE反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠制備型離心機(jī)SorvallSS-34轉(zhuǎn)頭步驟一、材料1.緩沖液與溶液10X擴(kuò)增緩沖液氯仿dATP(1mmol/
純化的RNA的點雜交和狹線雜交2021/12/21
原理點雜交和狹線雜交技術(shù)（Kafatosetal.1979)用于在同一固相支持物（通常為帶電荷的尼龍膜）上固定幾種核酸樣品，然后用合適的探針與已固定的樣品雜交，并由此判斷靶序列的濃度。通過估計樣品點發(fā)射出的信號的強(qiáng)度，與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品信號強(qiáng)度進(jìn)行比較，確定待測樣品中靶序列的量。材料與儀器RNA檢測樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對照探針標(biāo)記與變性NaOH預(yù)雜交液RNA變性液SSC印跡裝置絞鏈儀帶正電荷尼龍膜厚印透紙水浴鍋步驟一、材料1.緩沖液與溶液NaOH(10mol/L)預(yù)雜交液RNA變性液0.1XSSC
從鼠尾或其他小樣本中制備基因組DNA2021/12/20
原理這一簡單的實驗方案在成百上千的實驗室被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因或基因剔除小鼠的基因型鑒定以及從小量培養(yǎng)的細(xì)胞或組織塊中提取DNA。材料與儀器蛋白酶K培養(yǎng)的細(xì)胞鼠尾或小鼠組織乙醇異丙醇酚氯仿異戊醇磷酸鹽緩沖溶液SNETTESorvall離心機(jī)及H1000B、SH-3000轉(zhuǎn)頭聚丙烯管振蕩平臺振蕩平臺或振動孵箱Shepherd氏鉤步驟一、材料1.緩沖液及溶液乙醇異丙醇酚：氯仿：異戊醇（25:24:1V/V)磷酸鹽緩沖溶液SNET（20mmol/LTris-Cl(pH8.0)，5mmol/LEDTA(pH
從96孔微培養(yǎng)板生長的哺乳動物細(xì)胞中分離DNA2021/12/20
原理本方案由Ramirez-solis等的方法1992，1993改進(jìn)而成，是一種從微培養(yǎng)板的每個孔生長的真核細(xì)胞抽提基因組DNA的簡便有效的方法。每個孔產(chǎn)生的基因組DNA足以做數(shù)次聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)或者一次Southern雜交。對于制備用于PCR反應(yīng)的基因組DNA的最佳方法。材料與儀器限制性內(nèi)切核酸酶無DNase的RNase細(xì)胞細(xì)胞裂解緩沖液乙醇NaCl乙醇溶液磷酸鹽緩沖液蔗糖凝膠上樣緩沖液TE抽氣設(shè)備多通道移液器溫箱振搖平臺Tupperware容器步驟一、材料1.緩沖液和溶液細(xì)胞裂解緩沖液
CPB沉淀法純化放射性標(biāo)記的寡核苷酸實驗2021/12/20
材料與儀器十六烷基溴化吡啶EDTA-TrisEDTA-Tris-DNA溶液乙醇-乙酸鈉溶液乙醇乙酸鈉TE(pH7.6)或適當(dāng)?shù)念A(yù)雜交液核酸和寡核苷酸純化的原料干冰乙醇浴步驟材料溶液和緩沖液稀釋貯存液至適當(dāng)濃度。十六烷基溴化吡啶（CPB)1%,m/V)將1gCPBW(sigma公司）溶于100ml水中，加熱并用磁力攪拌器攪拌溶液可加速溶解。待去污劑全部溶解后，將溶液冷卻至室溫，用硝酸纖維素濾膜過濾（0.45um孔徑）EDTA-Tris(0.5mol/L,pH6.0)用60ml水溶解0.1molED
從大規(guī)模裂解物中制備λ噬菌體顆粒實驗2021/12/20
原理從大規(guī)模培養(yǎng)物中制備的λ噬菌體，可在高鹽存在下用聚乙二酵(PEG)沉淀的辦法從裂解物中回收得到。殘余的細(xì)胞碎片和PEG可用氯仿抽提。在進(jìn)一步純化之前，建議測定噬菌體制備物的得率。材料與儀器大腸桿菌培養(yǎng)物氯仿NaCl聚乙二醇SM胰DNaseⅠSorvallGSA轉(zhuǎn)子或相當(dāng)型號量筒步驟一、材料1.緩沖液和溶液氯仿，NaCl(固體），聚乙二醇（PEG8000)（每500ml培養(yǎng)物大約用50g），SM。2.酶和緩沖液胰DNaseⅠ(1mg/ml)，胰RNase(1mg/ml)于TE中（pH7.6)。
cDNA文庫構(gòu)建2021/12/20
原理cDNA文庫是指某生物某發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經(jīng)典cDNA文庫構(gòu)建的基本原理是用Oligo(dT)作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機(jī)引物，給所合成的cDNA加上適當(dāng)?shù)倪B接接頭，連接到適當(dāng)?shù)妮d體中獲得文庫。其基本步驟包括：（1）mRNA的提純獲取高質(zhì)量的mRNA是構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫的關(guān)鍵步驟之一。（2）cDNA第一條鏈的合成。（3）cDNA第二條鏈的合成。（4）雙鏈cDNA的修飾。（5）雙鏈cDNA的分子克隆。（6）cDNA文庫的擴(kuò)
乙醇沉淀法2021/12/17
原理DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時,乙醇會奪DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合,其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來替代懈水乙醇(因為無水乙醇的價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95%乙醇昂貴)。但是加95%的乙醇使總體積增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA損失也增大,尤其用多次乙醇沉淀時,就會影響收得率。折中的做法初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙醇,最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的
測定用乙醇固定的 DNA 的含量2021/12/17
原理DNA和RNA在260nm處有一很高的吸收峰，利用這個原理我們測其OD260，再推算出其濃度。材料與儀器細(xì)胞樣品PBS緩沖液70%乙醇PI液離心機(jī)恒溫箱篩網(wǎng)步驟一、培養(yǎng)細(xì)胞的DNA含量的測定制備單細(xì)胞懸液于200μl的PBS緩沖液中；加入2ml預(yù)冷的70%乙醇，4℃保存；1.取單細(xì)胞懸液1——2×106個細(xì)胞于PBS（PH=7.2）緩沖液中；2.300g離心5分鐘，棄上清，反復(fù)兩次；3.重懸細(xì)胞于0.5mlPBS緩沖液中；4.將細(xì)胞懸液放置于2——3ml冷70%乙醇中，混勻，保存于4℃，至少
BSP克隆測序法2021/12/17
材料與儀器【材料】DNA目標(biāo)片段；【試劑】亞硫酸氫鹽；步驟基因組DNA制備亞硫酸氫鹽修飾DNA純化與回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測序注意事項1、組織樣本：-20℃或-80℃低溫冰箱中保存，液氮或者干冰運輸；市內(nèi)或短途運輸可冰袋運輸。若提供的材料為新鮮組織、血液細(xì)胞等生物材料，請?zhí)峁┳銐蛱崛?ug以上基因DNA的材料量。2、DNA樣本：體積≥20ul，濃度≥100ng/ul，DNA總量≥2ug，20℃保存，低溫冰袋運輸。3、血液樣本：要求保存于抗凝管中或凍存管中，體積大于2ml，請用干冰運送，保證DNA
變性RNA在膜上的轉(zhuǎn)移和固定2021/12/17
原理多數(shù)情況下，為檢測特定的靶mRNA，需先將RNA通過瓊脂糖電泳分離后，再從膠上轉(zhuǎn)移到二維支持物上，（通常用尼龍膜)，再與持異的標(biāo)記探針雜交。正如在Nonhem雜交中討論的情況，實驗者可采用多種試劑和膜用于RNA的轉(zhuǎn)移以達(dá)到RNA和膜緊密結(jié)合的效果。我們認(rèn)為，最佳的Nonhern印跡可通過在中性或堿性條件下將RNA從膠上轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。材料與儀器RNA樣品乙酸銨亞甲藍(lán)溶液浸潤液SSC轉(zhuǎn)移緩沖液印跡濾紙交聯(lián)設(shè)備玻璃皿尼龍膜有機(jī)玻璃或玻璃板裁紙刀片厚印跡濾紙可見光盒重物黃色濾光片步驟一、材料1.緩
哺乳動物 DNA 的快速分離2021/12/17
原理根據(jù)本方案制備的哺乳動物DNA約20~50kb，適于作PCR反應(yīng)的模板。DNA產(chǎn)量在0.5到3.0μg/mg組織之間變化，或者是5~15μg/300μl全血。材料與儀器無DNase的RNase蛋白酶K哺乳動物組織或全血細(xì)胞裂解緩沖液乙醇異丙醇醋酸鉀溶液紅細(xì)胞裂解緩沖液TE連有真空管的抽吸裝置微量離心研棒水浴步驟一、材料1.緩沖液及溶液細(xì)胞裂解緩沖液（10mmol/LTris-Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)，0.1%（m/V）SDS）乙醇異丙醇醋酸鉀溶液（60ml的5
薄層層析法測定氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶含量實驗2021/12/17
材料與儀器用攜帶感興趣DNA的pCAT載體轉(zhuǎn)染的哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞CAT反應(yīng)混合物1乙基乙酸裂解緩沖液不含鈣鹽和鎂鹽的磷酸鹽緩沖液薄層層析（TLC)溶劑Tris-Cl放射性墨水干冰乙醇浴不溶于乙醇的墨水的記號筆旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器橡膠棒薄層層析板薄層層析槽預(yù)設(shè)為65°C的水浴步驟材料緩沖液和溶液貯存液、緩沖液和試劑的組分請見附錄1。貯存液稀釋到適當(dāng)濃度。CAT反應(yīng)混合物11mol/LTris-Cl(pH7.8)50ul[14C]氯霉素(60mCi/mmol,用水稀釋到0.1mCi/ml)10ul乙酰輔酶
哺乳動物細(xì)胞抽提物中熒光素酶的測定實驗2021/12/16
原理螢光素酶是理想的報告基因，因為哺乳動物細(xì)胞中不含內(nèi)源性螢光素酶，一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶，同時在所有的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，它的光產(chǎn)物具有最高的量子效率，檢測靈敏度高。熒光素酶報告基因被廣泛用于miRNA靶基因驗證。熒光素酶報告基因的原理在于miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用，可以將目的基因3’UTR區(qū)域構(gòu)建至pGL3-basic載體中報告基因Luciferase的后面，構(gòu)建熒光素酶質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，通過比較過表達(dá)或者干擾miRNA后，檢測報告基因表達(dá)的改變（監(jiān)測
BAL31 核酸酶消化法產(chǎn)生雙向缺失突變體實驗2021/12/16
材料與儀器BAL31緩沖液EGTA乙醇酚氯仿醋酸鈉蔗糖凝膠上樣緩沖液TE噬菌體T4DNA聚合酶BAL31核酸酶大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段限制性內(nèi)切酶瓊脂糖凝膠用于凝膠電泳的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)計時鐘水浴步驟材料緩沖液和溶液貯存液，緩沖液和試劑的成分請參閱附錄1,將貯存液稀釋到合適的濃度。5XBAL31緩沖液2.5mol/LNaCl62.5mmol/LCaCl262.5mmol/LMgCl2100mmol/LTris-Cl(pH8.0)有4種dNTP的溶液，每種濃度為0.5mmol/LEG
人生長激素的放射免疫分析法2021/12/16
材料與儀器hGH表達(dá)質(zhì)粒洗滌液親和素包被珠試管γ計數(shù)儀步驟1.取轉(zhuǎn)染了hGH表達(dá)質(zhì)粒的哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)液100~500μl。2.加100μl培養(yǎng)液或標(biāo)準(zhǔn)品至12mm×75mm圓底試管中。加入100μl125I-標(biāo)記的抗體溶液，混合。加入1顆親和素包被珠，蓋上試管蓋或用Parafilm膜封口，室溫下在一水平旋轉(zhuǎn)器上以約170r/min搖動下溫育90min。3.加2ml冼滌液洗磁珠兩次。*吸干洗滌液。圖一、人生長激素表達(dá)載體4.將試管置于γ計數(shù)儀上計數(shù)1min。5.用試劑盒中的hGH標(biāo)準(zhǔn)品測得的數(shù)
CAT活性的相-抽提分析法2021/12/16
材料與儀器轉(zhuǎn)染細(xì)胞氯霉素Tris·ClTMPD二甲苯離心機(jī)離心管培養(yǎng)箱步驟一、來源于哺乳動物細(xì)胞1.按“CAT活性的層析分析法”中的步驟1~5的凍融法，制備哺乳動物細(xì)胞提取物。如果用胰蛋白酶消化或制細(xì)胞方法來收集細(xì)胞，則將原位裂解法的步驟1至4用以下的步驟2至4代替。2.室溫下，300g離心5min，棄去上清。每107細(xì)胞加入1ml低滲緩沖液，離心，棄上清。然后每107細(xì)胞加Triton裂解液200μl。二、來源于植物原生質(zhì)體1.室溫下，2000~4000g離心5min，將植物原生質(zhì)體細(xì)胞收集于
電解質(zhì)梯度測序膠 簡介2021/12/15
原理通過簡單地提高下槽緩沖液的鹽濃度，使凝膠底部的離子強(qiáng)度得以提高，在電泳過程中，鹽離子可以電泳進(jìn)入凝膠并產(chǎn)生重復(fù)性好的及有效的梯度。材料與儀器DNATBE乙酸鈉電泳儀步驟1.按基本方案步驟1~22灌制凝膠及進(jìn)行預(yù)電泳，但上槽緩沖液為0.5×TBE，下槽為1×TBE。2.按基本方案步驟23~26步準(zhǔn)備樣品及加樣。3.如需測≤400堿基的序列信息，加入3mol/l乙酸鈉于下槽緩沖液至終濃度1mol/l，執(zhí)行步驟5。4.如果需測大于400堿基的序列信息，先按步驟5進(jìn)行，電泳2~3h，然后加入3mol
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