線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）檢測(cè)試劑盒    BB-48122-1

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）檢測(cè)試劑盒

使用方法：

使用注意事項(xiàng)：

• 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。
• 細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。
• 染色后立即進(jìn)行分析。
• 標(biāo)記的條件因細(xì)胞種類而異，根據(jù)不同樣本的實(shí)際染色結(jié)果做相應(yīng)調(diào)整，在每次實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)先確定*條件。以下方法僅供參考。
• BBcellProbe^TM CA1探針容易受潮，穩(wěn)定性較差，注意干燥保存。
• 吸取BBcellProbe^TM CA1探針母液時(shí)要用干燥的新吸頭，不能使用含水的吸頭。
• 未使用完的BBcellProbe^TM CA1探針母液請(qǐng)擰緊螺旋蓋，避免受潮失效。
• BBcellProbe^TM CA1探針工作液含水，配制后不可以*保存，須現(xiàn)配現(xiàn)用。
• Ca²⁺通透劑配制工作液后可以保存。
• CA1探針和Ca²⁺通透劑融解后離心至管底部再打開螺旋蓋，防止開蓋時(shí)損失。

1. 試劑配制：
   1. BBcellProbe^TM CA1染色工作液配制：根據(jù)樣品數(shù)量用MPTP染色buffer稀釋 BBcellProbe^TM CA1探針10倍，配制成BBcellProbe^TM CA1染色工作液，充分混勻。
   2. Ca²⁺通透劑工作液配制：根據(jù)樣品數(shù)量用MPTP染色buffer 10倍稀釋 Ca²⁺通透劑（10X），配制成1X Ca²⁺通透劑工作液，充分混勻。

1. 細(xì)胞染色

2.1用MPTP染色buffer將樣品細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，使其密度為1×10⁶細(xì)胞/ml以上。

【注】：① 也可以用其他緩沖液如HBSS等制備單細(xì)胞懸液，但是用于加Ca²⁺通透劑的對(duì)照樣品的緩沖液必須含有Ca²⁺；

           ② BBcellProbe^TM CA1探針加載時(shí)不能含有血清；

           ③ 細(xì)胞必須為單細(xì)胞懸液。

2.2 按照500ul每管將細(xì)胞懸液等分，每個(gè)樣品等分成3份，并記錄編號(hào)。

【注】：后續(xù)染色順序：

1號(hào)管僅含BBcellProbe^TM CA1探針，

2號(hào)管含BBcellProbe^TM CA1探針和淬滅劑，

3號(hào)管含BBcellProbe^TM CA1探針，淬滅劑和通透劑，

另外準(zhǔn)備一管不加以上試劑的細(xì)胞樣品（4號(hào)管）用于流式儀器設(shè)置。

2.3 向上述每個(gè)樣品的三管細(xì)胞中分別加入5µl BBcellProbe^TM CA1探針工作液并混勻。

【注】：*該探針加載濃度在100-300倍稀釋，具體的使用濃度需根據(jù)不同細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。

2.4 向2號(hào)、3號(hào)管中加入5ul淬滅劑，并混勻。

【注】：淬滅劑加入2-5µl即可，具體的使用濃度需根據(jù)不同細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。

2.5 向3號(hào)管中加入5µl-10ul  Ca²⁺通透劑，并混勻。

2.6 在37℃避光孵育15分鐘。

2.7 離心力1000g以下離心5分鐘收集細(xì)胞。

【注】：此步可去除多余染料以及可能引起熒光淬滅的試劑。

2.8 用500µl MPTP染色buffer重懸細(xì)胞。

【注】：如果需要，也可進(jìn)行進(jìn)一步染色。如用標(biāo)記的Annexin V 檢測(cè)磷酯酰絲氨酸易位(BB-4101 Anneexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒)；用PI 檢測(cè)細(xì)胞活力；或者用BBcellProbe^TM M11探針檢測(cè)線粒體活力等。注意整個(gè)過程均需避光操作。

2.9 染色后，將樣品置于冰上，1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行流式分析。

3、細(xì)胞檢測(cè)

用不含試劑的細(xì)胞樣品（4號(hào)管）進(jìn)行流式儀器設(shè)置。用流式488nm激發(fā)器進(jìn)行熒光分析，BBcellProbe^TM CA1探針zui大激發(fā)波長(zhǎng)495nm，zui大發(fā)射波長(zhǎng)515nm。

1號(hào)管-僅含BBcellProbe^TM CA1探針：線粒體和胞漿有熒光，熒光信號(hào)較強(qiáng)；

2號(hào)管-含BBcellProbe^TM CA1探針和淬滅劑：僅線粒體呈現(xiàn)熒光，熒光強(qiáng)度居中；

3號(hào)管-含BBcellProbe^TM CA1探針，淬滅劑和通透劑：線粒體和胞漿熒光均被淬滅，熒光信號(hào)zui弱。

2號(hào)管和3號(hào)管熒光信號(hào)的變化說明線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔被激活。

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