PCR實驗室

◆ PCR Laboratory ◆

┃ 定義及應用領(lǐng)域

　　 PCR實驗室又叫基因擴增實驗室。PCR是聚合酶鏈式反應的簡稱。是一種分子生物學技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達納米級別，精確檢測乙肝病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量、是否復制、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人適合使用哪類抗病DU藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據(jù)。
     廣泛應用于生物學各個領(lǐng)域。例如：艾滋病檢測、乙型肝炎、禽疫病、癌基因的檢測和診斷，DNA指紋、個體識別、親子鑒定及法醫(yī)物證、動植物檢疫，動物及其衍生產(chǎn)品檢測，動物飼料、化妝品、食品衛(wèi)生檢測，轉(zhuǎn)基因作物與轉(zhuǎn)基因微生物檢測等。

┃ PCR實驗室的核心難題

      實驗室的平面布局、空調(diào)通風系統(tǒng)設(shè)計、氣流控制等都是圍繞同一個核心問題進行——“避免污染”，任何級別的醫(yī)院在建設(shè)PCR實驗室時，均需要提前考量各個因素，以保證標本的全環(huán)節(jié)質(zhì)量及實驗室的生物安全。  
1. 建設(shè)要求。PCR實驗室的建設(shè)需要設(shè)置標準的“四區(qū)”：試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、PCR擴增檢測區(qū)和擴增產(chǎn)物檢測區(qū)。每個獨立實驗區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染，并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。
2. 人員要求。進入PCR實驗室，需要經(jīng)過從基礎(chǔ)理論、實驗原理、規(guī)范操作、質(zhì)量保證到注意事項等規(guī)范的培訓，并獲取PCR上崗證。
3. 檢測風險。檢測過程中，樣本的開蓋，核酸提取的震蕩、離心都有可能生氣溶膠，有感染的風險。
4. 防護要求。必須按照生物安全三級實驗室的個人防護要求進入。

┃ 建立方法

1、建立樣品準備區(qū)
這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應該采取預防措施：⑴PCR產(chǎn)物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。⑵組織培養(yǎng)物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據(jù)應用的需要提取DNA或RNA。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開，這樣會產(chǎn)生氣溶膠。⑺任何時候都應該穿實驗服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間，經(jīng)常清洗。
2、樣品準備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準備區(qū)進行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。
3、建立前PCR區(qū)
該去專門用于準備各種反應，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。
4、PCR實驗室試劑的操作
⑴ 所用的所有溶液都應該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR試劑中使用的水都應該是高質(zhì)量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。⑷所用試劑都應該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。⑸ 所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。⑹新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。⑺樣品準備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。
5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物
⑴ 可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。⑵如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應混合物不夠經(jīng)濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。⑶作為一個規(guī)則，應該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。⑷陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。⑸當做陽性對照時，有兩個理由決定了應該使用最少數(shù)量的核酸。⑹由于必須有對照反應，對照模板的特點應該予以考慮。
6、控制污染的方法
已設(shè)計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能消除污染問題，但可以將污染降低幾個數(shù)量級。
7、后PCR區(qū)PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應該留出一個專門用于反應后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動。

┃ 注意事項
1、必須擁有標準的的PCR熒光實驗室;
2、檢測設(shè)備必須符合標準PCR熒光實驗室設(shè)置要求;
3、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認證;
4、檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務培訓并取得合格證書;
5、必須在無菌無塵環(huán)境下進行操作