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實(shí)時(shí)熒光定量PCR?。?/a>2019/09/18: 實(shí)時(shí)熒光定量PCR一種科學(xué)準(zhǔn)確的定量方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹。一.實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。1.Ct

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理2019/09/18: 一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理（一）定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。（二）實(shí)時(shí)原理1、常規(guī)PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。2、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析3、如何對(duì)起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析.4、幾個(gè)概

羊邊界病病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒2019/09/18: 產(chǎn)品及特點(diǎn)羊邊界病病毒(BorderDiseaseVirus，BDV)會(huì)引起羊邊界病，是新生羔羊以身體多毛、生長不良和神經(jīng)異常為主要特征的一種先天性傳染病。邊界病病毒的臨診表現(xiàn)主要取決于宿主的年齡。臨診疾病限于在懷孕期受到感染的新生或年幼羔羊。如一個(gè)羊群受到感染時(shí)，主要表現(xiàn)在繁殖季節(jié)不孕或流產(chǎn)增多，流產(chǎn)可發(fā)生于懷孕的任何時(shí)期，但以懷孕后90天左右為多。由于胎兒的嚴(yán)重畸型導(dǎo)致脊柱后側(cè)凸或關(guān)節(jié)變曲而表現(xiàn)為難產(chǎn)。邊界病病毒呈世界性分布，大多數(shù)飼養(yǎng)綿羊國家都有本病的報(bào)道，因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的

DS堿裂解法（試劑盒提?。┨崛≠|(zhì)粒2019/09/17: 實(shí)驗(yàn)方法原理堿裂解法是一種應(yīng)用為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)*分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA

PCR技術(shù)：反向PCR2019/09/17: 描述一種大聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)應(yīng)用的方法，使在已知序列的核心區(qū)邊側(cè)的未知DNA成幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增。用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切裂解含核心區(qū)的DNA，以產(chǎn)生適合于PCR增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環(huán)狀分子。PCR的引物同源于環(huán)上核心區(qū)的末端序列，但其方向性，使鏈的延長經(jīng)過環(huán)上的未知區(qū)而不是分開引物的核心區(qū)。這種反向PCR方法可用于擴(kuò)增本來就在核心區(qū)旁邊的序列，還可應(yīng)用于制備未知序列探針或測(cè)定邊側(cè)區(qū)域本身的上、下游序列。引言通常測(cè)定一個(gè)與已知序列相鄰的DNA序列是必要的，例如位于編碼DNA的上游和下游

PCR試劑盒熒光探針雙標(biāo)記法2019/09/17: 實(shí)驗(yàn)方法原理本實(shí)驗(yàn)用1μg/ml三尖杉酯堿HT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)也有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細(xì)胞。三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對(duì)急性粒細(xì)胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時(shí)，即可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。細(xì)胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)

熒光探針雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡2019/09/17: 實(shí)驗(yàn)方法原理本實(shí)驗(yàn)用1μg/ml三尖杉酯堿HT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)也有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細(xì)胞。三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對(duì)急性粒細(xì)胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時(shí)，即可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。細(xì)胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)

2×探針法 qPCR Mix 2×Probe qPCR Mix2019/09/16: 產(chǎn)品及特點(diǎn)本產(chǎn)品是基于熒光探針檢測(cè)的即用型PCR試劑盒，可以對(duì)靶片段進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析（quantitativePCR、qPCR）。產(chǎn)品含有經(jīng)過優(yōu)化的緩沖液組分、熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶、TaqDNA穩(wěn)定劑、dNTPs、MgCl2和穩(wěn)定劑等所有實(shí)時(shí)定量PCR所需要的成分，用戶只需加入基因組DNA或cDNA模板、引物和探針即可進(jìn)行探針法實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，具有廣泛的用途。本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：1.以2×Mix提供，用戶只需準(zhǔn)備模板、引物、探針和ROX染料（取決于qPCR儀器）即可以進(jìn)行探針法實(shí)時(shí)

細(xì)胞表面標(biāo)記的檢測(cè)技術(shù)活細(xì)胞免疫熒光技術(shù)－流式細(xì)胞儀標(biāo)本的制備2019/09/16: 實(shí)驗(yàn)方法原理活細(xì)胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，根據(jù)所測(cè)定的熒光強(qiáng)度和陽性百分率即可知相應(yīng)抗原的密度和分布。實(shí)驗(yàn)材料抗體血清試劑、試劑盒RPMI1640DPBS洗滌液固定液儀器、耗材玻璃管塑料管離心機(jī)顯微鏡實(shí)驗(yàn)步驟1.制備活性高的細(xì)胞懸液（培養(yǎng)細(xì)胞系、外周血單個(gè)核細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞等均可用于本法）2.用10％FCSRPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106～1×107/ml3.取40μl細(xì)胞懸液加入預(yù)先有特異性McA

用端粒酶誘導(dǎo)人類間充質(zhì)干細(xì)胞永生化實(shí)驗(yàn)2019/09/16: 實(shí)驗(yàn)方法原理1.從動(dòng)物或人組織中提取的細(xì)胞，在體外培養(yǎng)中，細(xì)胞會(huì)有不同程度的分裂增殖，稱為增殖性衰老。但是有些細(xì)胞在自發(fā)或其他條件誘導(dǎo)下可突破增殖性衰老，擁有無限增殖的能力，成為永生化細(xì)胞，骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞屬于多能干細(xì)胞，可作為組織工程種子細(xì)胞的來源。2.端粒酶對(duì)染色體的穩(wěn)定性及決定細(xì)胞生命周期起極其重要的作用。端粒酶或末端轉(zhuǎn)移酶是由兩個(gè)主要的亞單位構(gòu)成：RNA成分（hTR）和蛋白質(zhì)分解亞單位（hTERT），RNA（hTR）亞單位普遍表達(dá)于正常和腫瘤組織中，而蛋白質(zhì)分解亞單位（hTERT）

細(xì)胞周期測(cè)定BrdU滲入法2019/09/16: 實(shí)驗(yàn)方法原理細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過兩個(gè)細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個(gè)周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個(gè)周期，則兩條單

免疫熒光實(shí)驗(yàn)如何選擇和使用熒光直標(biāo)一抗，你需要注意這四點(diǎn)！2019/09/12: 一、選擇熒光標(biāo)記要匹配熒光直標(biāo)抗體的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)在于它為多重檢測(cè)提供了機(jī)會(huì)，比如現(xiàn)在一些先進(jìn)的流式細(xì)胞儀能檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞中20多個(gè)離散參數(shù)。在設(shè)計(jì)多重實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考慮每種熒光基團(tuán)的*性質(zhì)，如大吸收波長和大發(fā)射波長，消光系數(shù)和斯托克斯位移等因素。對(duì)于免疫熒光分析方法，人們要同時(shí)檢測(cè)組織或細(xì)胞樣本中的多個(gè)抗原，常常會(huì)利用直標(biāo)一抗進(jìn)行免疫熒光共染色，這時(shí)一般盡量選擇光譜重疊比較少的熒光基團(tuán)進(jìn)行組合。比如，我們會(huì)選擇一個(gè)AF488標(biāo)記的抗體和另一個(gè)AF647標(biāo)記的抗體進(jìn)行兩個(gè)不同蛋白的共染色。對(duì)于流式細(xì)胞分

石蠟切片免疫組化實(shí)驗(yàn)之即用型（Envision）快速酶免疫組化二步法2019/09/12: 實(shí)驗(yàn)方法原理根據(jù)聚合酶技術(shù)把辣根過氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子結(jié)合在多聚酶上形成多聚物分子,其與待檢的抗原特異性的結(jié)合后，加入底物顯色。實(shí)驗(yàn)材料石蠟切試劑、試劑盒PBS檸檬酸鹽緩沖液蒸餾水增強(qiáng)劑酶標(biāo)抗鼠兔聚合物蘇木素酒精二甲苯樹膠鹽酸二氨基聯(lián)苯胺儀器、耗材烘箱微波盒塑料切片架顯微鏡膠頭滴管實(shí)驗(yàn)步驟1.石蠟切片置于67℃烘箱中，烘片2小時(shí)，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。2.取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片

鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)SP法2019/09/12: 實(shí)驗(yàn)方法原理SP（streptavidin-perosidase）法，即鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法。SP法是常使用的方法。試劑、試劑盒二甲苯酒精PBS雙氧水枸櫞酸緩沖液羊血清工作液辣根過氧化物酶鏈霉素卵白素蘇木素DAB儀器、耗材冰箱顯微鏡燒杯玻璃缸實(shí)驗(yàn)步驟1.烤片：68℃，20min。2.常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水：二甲苯I20min?二甲苯II20min?00%酒精10min?100%酒精10min?95%酒精5min?80%酒精5min?70%酒精5min。3.阻斷滅活內(nèi)源性過氧

細(xì)胞凋亡之熒光探針雙標(biāo)記法2019/09/11: 實(shí)驗(yàn)方法原理本實(shí)驗(yàn)用1μg/ml三尖杉酯堿HT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)也有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細(xì)胞。三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對(duì)急性粒細(xì)胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時(shí)，即可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。細(xì)胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)

細(xì)胞凋亡之形態(tài)學(xué)檢測(cè)法2019/09/11: 實(shí)驗(yàn)方法原理根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，使用合適的顯微鏡檢測(cè)凋亡細(xì)胞形態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)材料Hela細(xì)胞Jurkat細(xì)胞試劑、試劑盒DAPIHoechst蒸餾水PBS儀器、耗材光學(xué)顯微鏡倒置顯微鏡透射電子顯微鏡熒光顯微鏡共聚焦激光掃描顯微鏡實(shí)驗(yàn)步驟一、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡1.未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。2.染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體

細(xì)胞凋亡之Annexin V/PI雙染色法2019/09/11: 實(shí)驗(yàn)方法原理細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，目前早期識(shí)別仍有困難。這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。AnnexinV是一種Ca+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強(qiáng)的抗凝血特性的血管蛋白，AnnexinV具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性。對(duì)PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露

植物細(xì)胞色素C氧化酶（COX）ELISA試劑盒2019/09/11: 本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷植物細(xì)胞色素C氧化酶（COX）ELISA試劑盒使用說明書檢測(cè)原理試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被細(xì)胞色素C氧化酶（COX）抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的細(xì)胞色素C氧化酶（COX）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。樣品收集、處理及

植物交替氧化酶（AOX）ELISA試劑盒2019/09/11: 本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷植物（Plant）交替氧化酶（AOX）ELISA檢測(cè)試劑盒使用說明書檢測(cè)原理試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被交替氧化酶（AOX）抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的交替氧化酶（AOX）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品含量。樣品收集、處理及

細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)之組織塊直接培養(yǎng)法2019/09/10: 實(shí)驗(yàn)材料孕鼠新生小鼠試劑、試劑盒RPMI1640培養(yǎng)基牛血清胰蛋白酶Hanks液酒精青霉素鏈霉素儀器、耗材培養(yǎng)瓶青霉素瓶廢液缸血球計(jì)數(shù)板蠟盤手術(shù)器械大頭針離心管小玻璃漏斗三角燒瓶平皿吸管試管移液管無菌紗布無菌眼科剪實(shí)驗(yàn)步驟一、將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時(shí)間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺(tái)內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_(tái)內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。二、用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。三、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1

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