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細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)問(wèn)題探究2023/07/17: 細(xì)胞轉(zhuǎn)染常見(jiàn)問(wèn)題一、轉(zhuǎn)染效率低影響轉(zhuǎn)染效率因素很多，主要因素有細(xì)胞培養(yǎng)物、血清、載體構(gòu)建、DNA質(zhì)量以及轉(zhuǎn)染技術(shù)等。1.沒(méi)有使用優(yōu)化條件：優(yōu)化陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑和DNA的量。2.DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑復(fù)合物在存在血清條件下形成。3.存在抑制劑：不要在用于制備DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基中使用抗生素，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，RPMI，硫酸軟骨素。透明質(zhì)酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。4.不恰當(dāng)?shù)募?xì)胞密度：轉(zhuǎn)染時(shí)融合度應(yīng)為70%-90%。5.陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑凍結(jié)：不要使用凍結(jié)的或儲(chǔ)存溫度

關(guān)于?血清熱滅活相關(guān)事項(xiàng)2023/07/10: 血清熱滅活的步驟在1970年代就已建立，至今成為很多實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)血清前處理步驟；但許多先前認(rèn)為必須熱滅活的原因，卻早已經(jīng)不再成立。至少70%的研究者對(duì)血清的滅活僅僅是因?yàn)樽裾粘Ｒ?guī)操作，或者說(shuō)認(rèn)為是理所當(dāng)然的。常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間，而時(shí)間則從15分鐘到60分鐘不等，其中zui常用的手法是56℃熱處理30分鐘。隨著血清采集、處理、加工工藝的提高，許多早先認(rèn)為是熱滅活的原因已經(jīng)不再成立，只有少數(shù)對(duì)血清進(jìn)行熱滅活的研究者在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了這一步驟的有效性和必要性。一、熱敏補(bǔ)體與熱滅活熱滅活

揭秘ELISA顯色淡原因及解決方案2023/07/03: ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassay）也就是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，是指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合，進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。下面揭秘ELISA顯色淡的八大原因及解決方案。原因一：試劑盒在運(yùn)輸途中時(shí)間太長(zhǎng)，溫度太高。解決方案：盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間，夏季應(yīng)放冰塊降溫。原因二：試劑盒未充分平衡。解決方案：試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開(kāi)盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）。原因三：培養(yǎng)箱溫度不足

影響PCR反應(yīng)結(jié)果的各組分綜述2023/06/27: PCR反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（10×PCRBuffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分組成。各個(gè)組份都能影響PCR結(jié)果的好壞。1．反應(yīng)緩沖液：一般隨TaqDNA聚合酶供應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含：50mMKCl，10mMTris-HCl（pH8.3室溫），1.5mMMgCl2。Mg2+的濃度對(duì)反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。濃度過(guò)高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過(guò)低，使產(chǎn)物減少。在各種單核苷酸濃度為

化學(xué)實(shí)驗(yàn)室安全注意事項(xiàng)匯總2023/06/05: 在實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn)，一定要注意實(shí)驗(yàn)的安全，畢竟化學(xué)藥品大多數(shù)都是電郵一定毒性的，一旦出現(xiàn)問(wèn)題，影響不容小覷，甚至可能會(huì)危及生命。一、化學(xué)實(shí)驗(yàn)室個(gè)人防護(hù)措施注意事項(xiàng)：1、眼睛及臉部的防護(hù)（1）、全防護(hù)眼鏡（眼睛及臉部是實(shí)驗(yàn)室中最易被事故所傷害的部位，因而對(duì)他們的保護(hù)尤為重要。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，氖實(shí)驗(yàn)人員必須戴安全防護(hù)眼鏡（2）、當(dāng)化學(xué)物質(zhì)濺入眼睛后，應(yīng)立即用水徹di沖洗。沖洗時(shí)，應(yīng)將眼皮撐開(kāi)，小心地用自來(lái)水沖洗數(shù)分鐘，再用蒸餾水沖，然后去醫(yī)務(wù)室進(jìn)行治療。（3）、面部防護(hù)用具用于保護(hù)臉部和喉部。為了防止可能的爆

PCR引物設(shè)計(jì)關(guān)鍵事項(xiàng)2023/05/29: PCR引物設(shè)計(jì)需要注意：1、引物長(zhǎng)度：一般為15～30個(gè)堿基，引物太短會(huì)降低擴(kuò)增特異性。引物過(guò)長(zhǎng)退火溫度會(huì)提高，不利于反應(yīng)的發(fā)生。2、引物序列：設(shè)計(jì)引物時(shí)堿基要隨機(jī)分布，避免堿基或核苷酸的重復(fù)導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)；引物間和引物自身序列也要盡量避免互補(bǔ)，防止形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。3、堿基分布：GC含量一般40-60%，含量過(guò)高或過(guò)低都不利于進(jìn)行反應(yīng)。其含量過(guò)低會(huì)使引物不穩(wěn)定；過(guò)高會(huì)引發(fā)非特異性擴(kuò)增。4、Tm值：引物的Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）+2（A+T），盡可能保證上下游引物的Tm值一致，一般

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)通用包含內(nèi)容闡述2023/05/24: 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的內(nèi)容其實(shí)非常多，要詳細(xì)看懂標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)，也不是太容易，大致來(lái)說(shuō)包括下面17個(gè)方面的內(nèi)容。1、定值機(jī)構(gòu)的名稱、地址該名稱（常在證書(shū)上端以顯著的字體寫(xiě)出）應(yīng)當(dāng)是對(duì)證書(shū)提供的信息負(fù)責(zé)的團(tuán)體或組織的名稱，如定值機(jī)構(gòu)。除名稱之外，還包括通訊地址、電-話，如果可能的話，也包括電子郵件地址。2、文件（證書(shū)）的標(biāo)題應(yīng)當(dāng)有清晰明顯的標(biāo)題，例如，分析證書(shū)或測(cè)量證書(shū)。出具臨時(shí)證書(shū)的偶然行為會(huì)使得同一批次標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品有一個(gè)以上的證書(shū)，而可能引起混亂，因此不鼓勵(lì)。3、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品的名稱標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/

描述增加特異性的引物的特點(diǎn)及引物退火溫度2023/05/15: 細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是PCR中最重要的一步。理想的引物對(duì)只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會(huì)同擴(kuò)增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個(gè)可以增加特異性的引物所具有的特點(diǎn)：①典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)te性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。②選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物

抗體的分裝與保存闡述2023/05/04: 機(jī)體在抗原物質(zhì)刺激下，由B細(xì)胞分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原抗體抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。免疫球蛋白是結(jié)構(gòu)及化學(xué)的概念，而抗體是生物學(xué)及功能的概念?？梢哉f(shuō)，所有抗體都是免疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白都是抗體。抗體保存得當(dāng)與否，直接決定了抗體的活性和使用效果。如果抗體保存得當(dāng)，大部分抗體活性都可以維持?jǐn)?shù)月甚至數(shù)年。1.收到抗體后請(qǐng)?jiān)?2000rpm離心1-5min，將附著在管壁或蓋內(nèi)的抗體全部離心下來(lái)后再打開(kāi)管蓋進(jìn)行分裝和保存！2.對(duì)絕大多數(shù)抗體來(lái)說(shuō)，保存在-20℃是wan全足夠

ELISA試劑盒配對(duì)抗體技能方法2023/04/26: ELISA試劑盒單克隆抗體制備時(shí)很多朋友會(huì)遇到這樣的問(wèn)題，即咱們免疫用的蛋白為原核表達(dá)蛋白而意圖蛋白是真核蛋白或病毒等，由于沒(méi)有規(guī)范品咱們做出來(lái)的抗體沒(méi)有辦法用規(guī)范品來(lái)驗(yàn)證是否與其發(fā)作反響，終究導(dǎo)致咱們做出的是無(wú)用抗體。以下內(nèi)容為試驗(yàn)室技能總結(jié)的幾種方法，期望對(duì)大家有所協(xié)助。一、若要檢測(cè)的抗原為某種新的病毒ELISA試劑盒辦法：1、很多做出該病毒某個(gè)蛋白的單克隆抗體；2、很多收集該病毒疑似感染動(dòng)物或人血液，用PCR的辦法進(jìn)一步斷定每份血液是否真的有該病毒存在；3、將你做出的很多抗體中的一個(gè)做符號(hào)

RT-PCR引物的設(shè)計(jì)原則把握2023/04/23: 1、引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。因此引物設(shè)計(jì)是否合理對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)有著至關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計(jì)時(shí)要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對(duì)引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個(gè)內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過(guò)程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。2、引物設(shè)計(jì)原則的把握包括:1、.引物長(zhǎng)度:一般為15～30bp，引物太短會(huì)影響PCR的特異性，引物太長(zhǎng)PCR的最適延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq酶的最適溫度，也影響反應(yīng)的特異性。2、.堿基分

血清和血漿制備方法2023/04/20: 血清和血漿均是不含細(xì)胞（包括血小板）等有形成分的血液液體部分，其主要區(qū)別是血清不含凝血因子和血小板，血漿則含有凝血因子，它們的制備方法如下：1、血清的制備：獲得的血液不能抗凝，盛于離心管或可以離心的器皿中，靜置或置37℃環(huán)境中促其凝固，待血液凝固后，將其平衡后離心（一般為3000rpm，離心5～10min），得到的上清液即為血清，可小心將上清吸出（注意切勿吸出細(xì)胞成分），分裝備用。2、血漿制備：在盛血的容器中先加人一定比例的抗凝劑（抗凝劑：血液=1：9，將血液加到一定量后顛倒混勻，離心（離心條件

細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)的污染源歸納2023/04/10: 細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)泛指所有體外培養(yǎng)，其含義是指從動(dòng)物活體體內(nèi)取出組織，于模擬體內(nèi)生理環(huán)境等特定的體內(nèi)條件下，進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使之生存并生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程很容易受到污染。一、常見(jiàn)的污染源如下：1、細(xì)菌：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響明顯。仔細(xì)檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時(shí)放氣時(shí)間足夠，壓力足夠！尤其是和儲(chǔ)存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)

原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞培養(yǎng)主要不同點(diǎn)2023/03/20: 一、定義不同：1、原代培養(yǎng)是指由體內(nèi)取出組織或細(xì)胞進(jìn)行的首ci培養(yǎng)，也叫初代培養(yǎng)。2、傳代培養(yǎng)是指需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程。對(duì)單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段。二、特點(diǎn)不同：1、原代細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。由于培養(yǎng)的細(xì)胞剛剛從活體組織分離出來(lái)，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、繁殖提供有力的手段。同時(shí)也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。2、當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培

PCR反應(yīng)主要五種物質(zhì)2023/03/13: PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。1、引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以zui低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。2、酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減

血清不穩(wěn)定原因及解決辦法參考2023/03/06: 血清，指血液凝固后，在血漿中除去纖維蛋白分離出的淡黃色透明液體或指纖維蛋白已被除去的血漿。其主要作用是提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、提供激素和各種生長(zhǎng)因子、提供結(jié)合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷、對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用。血清最大的劣勢(shì)就是不穩(wěn)定，不穩(wěn)定原因如下：1、來(lái)源不穩(wěn)定以胎牛血清為例，懷孕母牛在屠宰前腹部被剖開(kāi)，取出胎牛，在低溫?zé)o菌條件下，刺破胎牛的心臟以獲取血清。就這一條，動(dòng)物倫理組織就可以把你攔住嘮嘮。另外，牛血清必須來(lái)自有文件證明無(wú)牛海綿狀腦病的牛群或國(guó)家，我國(guó)在對(duì)牛血

化學(xué)試劑儲(chǔ)存應(yīng)防止事項(xiàng)合集2023/02/28: 化學(xué)試劑在貯存時(shí)常因保管不當(dāng)而變質(zhì)。有些試劑容易吸濕而潮解或水解；有的容易跟空氣里的氧氣、二氧化碳或擴(kuò)散在其中的其他氣體發(fā)生反應(yīng)，還有一些試劑受光照和環(huán)境溫度的影響會(huì)變質(zhì)。因此，現(xiàn)根據(jù)不同的生物試劑的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)的不同，常用化學(xué)試劑保存注意事項(xiàng)進(jìn)行以下總結(jié)：一、防揮發(fā)：1．油封2．水封3．臘封二、防光：1．硝酸銀，濃硝酸及大部份有機(jī)藥品應(yīng)該放在棕色瓶中。2．硝酸鹽存放在地下室中既防熱，又防光、防火還能防震。3．有機(jī)試劑櫥窗一律用黑漆涂染。4．實(shí)驗(yàn)室用色布窗簾，內(nèi)紅外黑雙層。三、防潮：1．過(guò)

詳述細(xì)胞株和細(xì)胞系三個(gè)方面不同2023/02/20: 生物細(xì)胞系和細(xì)胞株以傳代代數(shù)為區(qū)分，以遺傳物質(zhì)是否改變?yōu)闃?biāo)志，細(xì)胞株強(qiáng)調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞成分單一性，所有的遺傳、生化等特性wan全相同，細(xì)胞系不強(qiáng)調(diào)純度，但某一類細(xì)胞占多數(shù)。細(xì)胞株和細(xì)胞系的區(qū)別，一般包括三個(gè)方面：概念、形成方法和細(xì)胞的延續(xù)性。一、概念不同1、細(xì)胞株：細(xì)胞株（CellStrain）是通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的培養(yǎng)物稱為細(xì)胞株。2、細(xì)胞系：細(xì)胞系（cellline）指原代細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)首ci傳代成功后所繁殖的細(xì)胞群體。也指可長(zhǎng)期連續(xù)傳代的培

ELISA實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2023/02/15: 標(biāo)準(zhǔn)曲線法也稱為外標(biāo)法或直接比較法，是一種簡(jiǎn)便、快速的定量方法，在ELISA實(shí)驗(yàn)中比較常用的一種分析方法。一、ELISA試劑盒做標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品檢測(cè)時(shí)有幾個(gè)問(wèn)題需要注意1、樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來(lái)的，所以首先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實(shí)驗(yàn)還要重要的一件事，否則后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)從談起。2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個(gè)比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品的濃度，即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi)，人ELISA試劑盒包括上限和下限。而對(duì)于呈S型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，盡量要使實(shí)驗(yàn)樣

?一般ELISA試劑盒組成結(jié)構(gòu)成分2023/01/29: 一般ELISA試劑盒組成結(jié)構(gòu)：1、血清：操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血紅細(xì)胞迅速小心地分離。2、血漿：EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測(cè)。1000×g離心30分鐘去除顆粒。3、細(xì)胞上清液：1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。4、組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液。5、保存：如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆

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