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深圳市安培生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第5年
細(xì)胞勻漿的操作2021/11/24
材料與儀器細(xì)胞緩沖鹽溶液二異丙基氟瞬酸勻漿緩沖液相差顯微鏡步驟1.準(zhǔn)備下面的貯液和材料。等滲的緩沖鹽溶液（例如PBS，150mmol/LNaCl；10mmol/LNaPO4，pH7.2)二異丙基氟瞬酸（DIFP）1mol/L咪唑-HCl，pH7.00.5mmol/LK+EGTA，pH7.00.1mol/LK+ATP，pH7.00.1mol/LDTTNaN3蛋白酶抑制劑PMSF抑胃酶肽A亮抑酶肽刀豆胰蛋白酶抑制劑勻漿緩沖液：0.34mol/L蔗糖20mmol/L咪唑-HCl，pH7.05mmoI/
從培養(yǎng)的細(xì)胞中純化總RNA的方法2021/11/24
材料與儀器細(xì)胞RNA提取緩沖液變性液水飽和酚培養(yǎng)皿Falcon2063管步驟1.取1個(gè)細(xì)胞已長(zhǎng)滿的100ml培養(yǎng)皿，吸出培養(yǎng)液，加2mlRNA提取緩沖液，用橡膠刮棒刮下細(xì)胞。RNA提取緩沖液：變性液，20mlβ-巰基乙醇，0.144ml2mol/L乙酸鈉，pH4，2ml水飽和酚，22ml可避光保存在4℃2~3個(gè)月。變性液：4mol/L硫氰酸胍：250g硫氰酸胍25mmol/L檸檬酸鈉：17.6ml0.75mol/L檸檬酸鈉，pH70.5%十二烷基肌氨酸鈉（Sarkoayl）：26.4ml10%十
純化質(zhì)粒（堿裂解法）2021/11/18
材料與儀器大腸桿菌LB葡萄糖緩沖液乙酸鉀離心管步驟1.單個(gè)大腸桿菌克隆接種到2ml含適當(dāng)抗生素的LB中。37℃劇烈振蕩孵育5~8小時(shí)?；蛘呖梢耘囵B(yǎng)過夜使飽和。2.倒1.5ml培養(yǎng)液到已作標(biāo)記的微量離心管中。把剩下的培養(yǎng)液存放在4℃。3.在微量離心機(jī)上離心2分鐘以沉淀大腸桿菌。吸掉培養(yǎng)液。4.用100ul葡萄糖緩沖液重懸沉淀物。在室溫孵育5分鐘。在這時(shí)候充分懸浮大腸桿菌對(duì)于獲得盡可能大的產(chǎn)量是很重要的。葡萄糖緩沖液（配500ml）50mmol/L葡萄糖4.5g葡萄糖10mmol/LEDTA，pH8
基因組DNA的快速純化方法2021/11/18
材料與儀器尾部緩沖液蛋白酶K離心管玻璃棒步驟第1天1.大約1.5cm長(zhǎng)的尾部活檢樣品放在一個(gè)1.5ml盛有0.7ml尾部緩沖液的小離心管中，加35ul10mg/ml蛋白酶K，在55℃振搖溫育過夜。尾部緩沖液（配25ml）50mmol/LTris，pH81.25ml1mol/LTris，pH8100mmol/LEDTA，pH85ml0.5mol/LEDTA，pH8100mmol/LNaCI0.5ml5mol/LNaCI1%SDS1.25ml20%SDS存放于室溫。蛋白酶K：10mg/ml水溶液，貯
如何從哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織分離DNA2021/11/18
材料與儀器細(xì)胞TBS抽提緩沖液離心管步驟1.根據(jù)樣品類型，從下列方法中選一個(gè)作為步驟1進(jìn)行操作。(1)細(xì)胞樣品①單層培養(yǎng)的細(xì)胞以用冰預(yù)冷的TBS將單層細(xì)胞洗滌2次，用刮棒把細(xì)胞刮入約0.5ml的TBS中，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到冰浴的離心管中，用1mlTBS沖洗培養(yǎng)皿，并入離心管中的細(xì)胞懸液。于4℃以1500g離心10分鐘以收獲細(xì)胞。用5~10倍體積經(jīng)冰預(yù)冷的TBS重懸細(xì)胞并再度離心。用TE(pH8.0）重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度為5x107細(xì)胞/ml，轉(zhuǎn)移至一個(gè)三角燒瓶中（1ml細(xì)胞懸液用50ml燒瓶；2m
如何從組織中分離制備細(xì)胞核基質(zhì)/中間纖維支架結(jié)構(gòu)？2021/11/18
材料與儀器新鮮組織NaCl緩沖液細(xì)胞骨架緩沖液Teflon研杵Doume勻漿器步驟1.在4℃將新鮮組織切成1mm3左右的小塊。在4℃，用Teflon研杵和Doume勻漿器在含0.5%TritronX-100的細(xì)胞骨架緩沖液中對(duì)切碎的組織進(jìn)行勻漿，直到?jīng)]有可見的團(tuán)塊。每克組織用大約10ml緩沖液。含0.5%TritonX-100的細(xì)胞骨架緩沖液：10mmol/LPIPES，pH6.8300mmoI/L蔗糖100mmoI/LNaCI3mmol/LMgCl21mmol/LEGTA2.用一250μm孔徑
如何從培養(yǎng)細(xì)胞中制備細(xì)胞核基質(zhì)/中間纖維骨架結(jié)構(gòu)？2021/11/18
材料與儀器細(xì)胞TritronX-100抽提緩沖液電子顯微鏡步驟1.在4℃用PBS洗細(xì)胞一次。2.在4℃用含0.5%TritronX-100的細(xì)胞骨架緩沖液抽提細(xì)胞3到5分鐘。直到消化步驟，每107個(gè)細(xì)胞最少要用1ml緩沖液，以后減半。3.在4℃用抽提緩沖液抽提細(xì)胞3~5分鐘。這一步去除組蛋白H1和除中間纖維蛋白之外的細(xì)胞骨架蛋白。另外，這一步也可在DNA酶消化步驟（第4步）之后作，這樣也不會(huì)引起超微結(jié)構(gòu)的變化。抽提緩沖液：10mmol/LPIPES，pH6.8250mmol/L硫酸銨300mmo
如何從肝臟組織中制備細(xì)胞核？2021/11/17
材料與儀器大鼠裂解緩沖液濃蔗糖溶液超速離心機(jī)組織研磨器步驟1.配制裂解緩沖液和濃蔗糖溶液（PMSF在使用前添加），冰上放置。裂解緩沖液：0.25mol/L蔗糖網(wǎng)織紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（RSB）0.25mol/L蔗糖（超級(jí)純）10mmol/Tris-HCl(pH7.4)10mmol/LNaCl3mmol/LMgCl21mmol/LDTT0.5mmol/LPMSF(用前從溶于乙醇的100mmol/L貯存液中添加）濃蔗糖溶液：2mol/L蔗糖RSB2mol/L蔗糖（超級(jí)純）10mmol/LTris-HCl
如何從擬南芥菜中分離葉綠體？2021/11/17
材料與儀器葉組織研磨懸浮緩沖液燒杯Polytron勻漿器步驟1.組織勻漿(1)收集10g葉組織，放進(jìn)一400ml的燒杯中。(2)加入200ml冰冷的研磨懸浮緩沖液。在4℃的房間中，用Polytron勻漿器進(jìn)行6~7個(gè)3秒鐘脈沖勻漿葉組織。研磨重懸緩沖液：10mmol/LEDTA50mmol/LHEPES-KOH，pH8.00.33mol/L甘露醇0.5g/LBSA(無脂肪酸）5mmol/L抗壞血酸鹽（用前添加）(3)用網(wǎng)層米拉布（Calbiochem)過濾勻漿，濾液倒進(jìn)4個(gè)50ml離心管中。2.
葉綠體分離的操作方法2021/11/17
材料與儀器葉子組織PBF-Percoll溶液山梨醇BSAHEPES-KOHEDTA聚碳酸酯離心管步驟1.制備Percoll梯度(1)兩個(gè)50ml的聚碳酸酯離心管中分別加入25ml50%的PBF-Percoll溶液。50%PBF-Percoll0.33mol/L山梨醇50mmol/LHEPES-KOH，pH8.02mmol/LEDTA1mmol/LMgCl21mmol/LMnCI250%Percoll(v/v)3%PEG6000(w/v)1%BSA(無脂肪酸，比如Sigma的A7030）1%Fic
從組織培養(yǎng)細(xì)胞中制備粗微體的方法2021/11/17
材料與儀器細(xì)胞環(huán)己酰亞胺勻漿緩沖液培養(yǎng)皿步驟1.培養(yǎng)基中加入環(huán)己酰亞胺（溶于蒸餾水，貯存液濃度0.1mol/L，-20℃保存。如果不溶，試著加熱到40℃以幫助溶解）（終濃度10μmol/L)，37℃保溫5~10分鐘。2.培養(yǎng)皿從37℃轉(zhuǎn)移到冷室，立即去掉培養(yǎng)基，用含有與培養(yǎng)基同樣環(huán)己酰亞胺濃度的冰冷PBS洗滌細(xì)胞3次，將培養(yǎng)皿口朝下倒立于紙巾上數(shù)分鐘，偶爾拍打。用Kimwipe紙巾擦掉側(cè)壁上殘留的PBS。3.加入0.7ml含有2~4單位/mlRNase-IN(BoehringerMannheim
從狗的胰臟中制備粗微體2021/11/17
材料與儀器胰臟HM緩沖液蔗糖-緩沖液三乙基氨基乙酸緩沖液步驟1.從動(dòng)物身體切下胰臟，立即用大約50ml冷HM緩沖液沖洗，放置于干凈的紙巾上，去除結(jié)締組織：勻漿介質(zhì)（HM）0.25mol/L蔗糖-緩沖液A緩沖液A：50mmol/L三乙基氨基乙酸緩沖液（TEA），pH7.550mmol/LKOAc6mmol/LMg(0Ac)21mmol/LEDTA0.5mmol/LPMSF貯存液：1mol/L三乙醇氨緩沖液，pH7.54mol/LKOAc，pH7.51mol/LMg(OAc)2PMSF：100mmo
從大鼠肝臟制備微體的方法2021/11/16
材料與儀器雄大鼠蔗糖蔗糖HM玻璃板步驟1.用斷頸法殺死約150g重的雄大鼠，大鼠的數(shù)量取決于要制備的粗微體的數(shù)量。由于一個(gè)150g重的大鼠肝（6g）大約每克肝蛋白含有10mg粗微體，所以大鼠的數(shù)量可以以回收率為50%來進(jìn)行估計(jì)。2.流干血液后，打開腹部和胸腔，切取肝，將它們放在盛有冰冷勻漿介質(zhì)的燒杯中：勻漿介質(zhì)（HM）：0.5mol/L蔗糖1mmol/LDTT3.用冰冷HM沖洗大鼠肝，將它們放在紙巾上，如果有結(jié)締組織去掉之，迅速稱重。4.將肝放在干凈的玻璃板上，用剃須刀片將其切成盡可能小的碎片，
從海星的無脊椎動(dòng)物系統(tǒng)獲取配子的實(shí)驗(yàn)2021/11/16
材料與儀器海星（米青）子懸液海水巴斯德吸管步驟1.選擇帶有凸起臂的動(dòng)物，這些動(dòng)物是具有配子的成熟動(dòng)物。2.小心地將巴斯德吸管插入接近中央板的臂內(nèi)，就會(huì)獲得一些配子，這樣也分辨出動(dòng)物的性別，并且對(duì)動(dòng)物的損害最小。3.從雌性獲取卵巢：從中央板取下臂并解剖開該臂，用鑷子將卵巢取出，握住卵巢使輸卵管閉合，用海水沖洗，之后轉(zhuǎn)移到一盤海水中。4.5~10分鐘后，取出卵巢，卵子應(yīng)已釋放出來，使其沉積下來，倒掉海水并加入潔凈的海水。5.從雄性獲?。浊啵┳樱簭男坌院Ｐ堑脑摫壑腥〕霾G丸，用潔凈的海水沖洗。6.取一
從海膽和沙幣等無脊椎動(dòng)物系統(tǒng)獲取配子的實(shí)驗(yàn)方法2021/11/16
材料與儀器海膽和沙幣KCl溶液3-氨基-124-三唑巴斯德吸管Nytex濾器步驟一、海膽和沙幣體腔內(nèi)注射0.5mol/L的KCl1.制備0.5mol/L的KCl溶液。2.用海水沖洗一下動(dòng)物以去掉顆粒物質(zhì)。3.用一個(gè)23~26號(hào)的針頭向動(dòng)物的口緣空腔內(nèi)注射多達(dá)500μl或100μlKCl。4.用巴斯德吸管收集“干”（米青）子，并儲(chǔ)存于置于冰上的小塑料管中?！?.將雌性動(dòng)物在一杯海水中翻過來收集卵子。6.用Nytex濾器洗卵子，以去掉顆粒，并使卵子吸附到濾膜上。7.通過將水吸走或小心倒掉，再加入潔凈
成年大鼠心室肌肉細(xì)胞的分離和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法步驟2021/11/16
材料與儀器鼠KH緩沖液混合氣體對(duì)流工作臺(tái)或?qū)恿魇匠瑑襞_(tái)乙（酉迷）罩冷凝器循環(huán)水浴和水浴搖床圈型架蠕動(dòng)泵臺(tái)式醫(yī)用離心機(jī)無菌燒杯ColorpHastpH試紙步驟一、ARVM細(xì)胞分離的準(zhǔn)備工作1.準(zhǔn)備如下設(shè)備及器材：對(duì)流工作臺(tái)或?qū)恿魇匠瑑襞_(tái)乙（酉迷）罩冷凝器循環(huán)水浴和水浴搖床帶夾的圈型架免蠕動(dòng)泵臺(tái)式醫(yī)用離心機(jī)95%O25%CO2混合氣體400ml無菌燒杯ColorpHastpH試紙（精密型）2.在對(duì)流式或?qū)恿魇焦ぷ髋_(tái)中，裝配Langedorff系統(tǒng)，把冷凝器和三通管夾著固定在圈型架上，管子接上蠕動(dòng)泵。
成纖維細(xì)胞的分離方法2021/11/16
步驟1)胚胎的分離。適用哺乳動(dòng)物（倉鼠、小鼠和大鼠）a.采用認(rèn)可的方案處死嚙齒動(dòng)物。b.立即在無菌超凈臺(tái)內(nèi)用70%乙醇擦洗整個(gè)動(dòng)物。若可能，置紫外燈下照射5分鐘。c.用無菌的鑷了和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。d.用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培蕎皿上。e.剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的燒瓶中。f.漂洗胚胎，去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。適用雞胚胎a.用70%乙醇擦洗雞蛋殼。b.用無菌剪刀輕敲雞
成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟2021/11/15
材料與儀器骨標(biāo)本HamsF12培養(yǎng)液用于細(xì)胞傳代的胰蛋白酶液分離成骨細(xì)胞的消化液Petri培養(yǎng)皿培養(yǎng)瓶手術(shù)刀手術(shù)鑷步驟一、外植塊培養(yǎng)1.從手術(shù)室獲得骨標(biāo)本。2.在室溫條件下，用無菌生理鹽水浸洗骨組織數(shù)次。3.如果骨組織不能及時(shí)使用，將骨標(biāo)本放入含有12%FBS、青霉素和硫酸鏈霉素的Ham’sF12（添加12%FBS、2.3mmol/LMg2＋、100U/ml青霉素和100ug/ml硫酸鏈霉素）培養(yǎng)液中。骨標(biāo)本可在4℃條件下儲(chǔ)存過夜。4.次日早晨，用含有100U/ml青霉素和100ug/ml硫酸鏈
從骨骼肌分離和培養(yǎng)單肌纖維的方法步驟2021/11/15
材料與儀器MatrigelDMEML-谷氨酰胺Ⅰ型膠原蛋白青霉素和鏈霉素混合液雞胚提取液馬血清胎牛血清接種培養(yǎng)液增殖培養(yǎng)液Petri培養(yǎng)皿改良Pasteur吸管24孔培養(yǎng)板鉆石筆透照立體解剖顯微鏡步驟1.處死動(dòng)物后立即切除肌肉。注意夾持肌腱，以減少對(duì)肌纖維的損傷。2.將肌肉放入0.2%Ⅰ型膠原蛋白酶液（W/V，用DMEM配制），在35°C條件下用搖動(dòng)水浴箱孵育60~90min。較大肌肉需要較長(zhǎng)消化時(shí)間，一般情況下取自6~8周大鼠的趾長(zhǎng)伸肌需消化60min。3.準(zhǔn)備盛肌纖維的Petri培養(yǎng)皿，即用
從成年骨骼肌分離和培養(yǎng)成肌細(xì)胞的方法步驟2021/11/15
材料與儀器D-PBSA轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)液生長(zhǎng)培養(yǎng)液鏈酶菌蛋白酶液尼龍網(wǎng)手術(shù)刀鋒利的長(zhǎng)剪刀Petri培養(yǎng)皿培養(yǎng)瓶20ml離心管或一般容器血細(xì)胞計(jì)數(shù)板步驟一、分離1.用手術(shù)刀切除活檢組織塊上的非肌性組織，然后用D-PBSA浸洗。2.稱重前，與肌纖維平行將切除活檢組織切成片，用沖洗。3.將組織片平行放入Petri培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，切成較薄的柱狀組織塊，然后切成1mm3小塊。不要擠壓組織。也可在試管內(nèi)用長(zhǎng)剪刀將組織剪成小塊，應(yīng)避免擠壓組織。4.用D-PBSA浸洗組織塊，靜置后吸去上清液。5.在37°C條件下，用鏈酶菌
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