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TUNEL法檢測細胞凋亡實驗原理和方法2018/08/20

細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30﹪的染色體DNA在Ca2和Mg2依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’-末端，從而可進行凋亡細胞

噬菌體的檢查及效價測定2018/08/20

1、目的：1.1了解噬菌體效價的含義及其測定原理。1.2學(xué)會檢查噬菌體的方法。1.3掌握用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價的操作技能。2、原理：噬菌體是一類專性寄生于細菌和放線菌等微生物的病毒，其個體形態(tài)極其微小，用常規(guī)微生物計數(shù)法無法測得其數(shù)量。當烈性噬菌體侵染細菌后會迅速引起敏感細菌裂解，釋放出大量子代噬菌體，然后它們再擴散和侵染周圍細胞，終使含有敏感菌的懸液由混濁逐漸變清，或在含有敏感細菌的平板上出現(xiàn)肉眼可見的空斑──噬菌斑。了解噬菌體的特性，快速檢查、分離，并進行效價測定，對在生產(chǎn)和科研工作

蛋白質(zhì)提取與純化技術(shù)2018/08/14

以蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，從分子水平上認識生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學(xué)和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整

細胞培養(yǎng)中支原體污染的特點及檢驗的筆記2018/08/14

近看大家常提到支原體污染，就翻了翻書，做了些筆記，現(xiàn)在貼出來和大家分享：支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(小直徑0．2um)并獨立生活的微生物。約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態(tài)呈高度多形性?？蔀閳A形、絲狀或梨形。支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。支原體代謝需固醇類物質(zhì)、部分種類需要精氨酸、

NK細胞介導(dǎo)的細胞溶解作用的研究2018/08/10

前言自然殺傷細胞(NatureKillerCells,NK)是骨髓衍化的淋巴細胞，其初通過巨大的顆粒性狀被識別。NK細胞能自發(fā)殺滅多種腫瘤細胞，同時還可保護正常的細胞，從而被認為是癌癥的克星。重要的是，不管是在胞內(nèi)還是胞外，NK細胞不需要免疫接種或提前激活，就能夠自發(fā)溶解特定的腫瘤靶細胞，而T細胞必須要通過抗原遞呈細胞的協(xié)助才能發(fā)揮作用。許多胞內(nèi)外的實驗表明,除了外滲出和滲入腫瘤組織的能力外，NK細胞還有望具有抗腫瘤的能力。研究發(fā)現(xiàn)缺失NK細胞的小鼠在致癌物誘下更容易發(fā)產(chǎn)生癌癥。另外，缺乏NK細

活體成像中熒光色素標記細胞的方法舉例2018/08/10

活體成像中熒光色素標記細胞的方法舉例活體光學(xué)成像(OpticalinvivoImaging)主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）技術(shù)與熒光（fluorescence）技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標記細胞或DNA，今天，生物發(fā)光標記物可以標記到任何一種基因上，使對基因功能的全面細致研究成為現(xiàn)實。而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團（GFP、RFP,Cyt及dyes等）進行標記，利用熒光蛋白在外源光源或是內(nèi)源發(fā)光照射下被激發(fā)產(chǎn)生的熒光作為檢測信號。研究人員能夠利用一套

一氧化氮（NO）信號通路研究2018/08/10

一氧化氮（NO）信號通路研究一氧化氮合酶（NOS）抑制劑研究背景：一氧化氮（NO）是自分泌和旁分泌的信號通路分子，可以擴散進入生物膜。發(fā)揮作用時間很短（幾秒鐘），主要的生理功能是促進血管動態(tài)平衡。它能夠抑制平滑肌收縮生長，阻止血小板凝聚以及防止白細胞-內(nèi)皮細胞粘附。另外它還參與免疫防御系統(tǒng)，神經(jīng)傳遞，血管生成等過程。NO的下游靶標包括鳥苷酸環(huán)化酶和NF-κB，前者可以提高cGMP水平，后者在iNOS基因表達作為重要的轉(zhuǎn)錄因子。體內(nèi)NO水平和信號失調(diào)常發(fā)生于某些疾病狀態(tài)。糖尿病病人具有低于的NO水

小鼠胚胎成纖維細胞MEF培養(yǎng)相關(guān)知識總結(jié)2018/08/09

小鼠胚胎成纖維細胞的富集1、給13-14天的孕鼠注射大約0.5ml阿佛丁。當鼠麻醉后，實施斷頸法處死小鼠。2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮膚向后拉，暴露出腹膜。用消毒過的工具，剪開腹壁以暴露出子宮角。將子宮角移到10cm的皿里。用10ml不含鈣鎂離子的PBS洗三遍。3、用剪刀剪開每一測的胚囊,并將胚胎移到培養(yǎng)皿中。4、用兩副鐘表鑷子將胎盤和膜與胚胎分離開，分離后切除內(nèi)臟（所有深色的東西）。將胚胎轉(zhuǎn)移到(有蓋)培養(yǎng)皿中，用10ml不含鈣鎂離子的PBS洗三遍。5、用帶有彎鉤的眼科剪將組織剪碎，當你剪的

考馬斯藍染色法原理2018/08/09

相關(guān)專題Bradford法檢測蛋白濃度專題考馬斯亮藍法也稱考馬斯藍染色法(coomassiebluestaining)又稱Bradford法。由于其突出的優(yōu)點，正得到越來越廣泛的應(yīng)用。考馬斯亮藍G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。在游離狀態(tài)下呈紅色，大光吸收在488nm;當它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G-25

小鼠睪丸、附睪及輸精管精子采集、運動能力檢測與結(jié)構(gòu)觀察實驗2018/08/09

本實驗?zāi)康氖钦莆招∈蟛G丸、附睪及輸精管精子采集方法；掌握血球計數(shù)板法精子計數(shù)和運動能力檢測的方法；通過睪丸、附睪及輸精管精子運動能力檢測，認識精子在睪丸產(chǎn)生后，在附睪內(nèi)成熟的過程；掌握精子抹片方法；掌握染色法進行精子結(jié)構(gòu)觀察和頂體結(jié)構(gòu)觀察的方法，認識精子的正常結(jié)構(gòu)。實驗方法原理哺乳動物的精子形成后必須經(jīng)過在附睪內(nèi)發(fā)生一系列形態(tài)、生理和生化方面的變化而終達到成熟后，才能獲得向前運動的能力，這種向前運動是精子受精能力的重要指標。哺乳動物精子包括頭部和尾部二個主要部分，頸部介于頭部和尾部之間，形成頭部

殺傷細胞功能的檢測實驗2018/08/09

殺傷功能是機體免疫功能的一個重要方面，免疫系統(tǒng)中有多種具有殺傷功能的靶細胞，如自然殺傷細胞（NK）、細胞毒性T細胞（CTL）、具有ADCC作用的單核細胞巨噬細胞等實驗方法原理NK細胞存在于人或動物外周血、脾臟、淋巴結(jié)和骨髓中，能殺傷某些腫瘤細胞、病毒感染靶細胞，無需抗原或有絲分裂原刺激，也不依賴抗體或補體，在機體殺傷腫瘤、防御感染及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。LAK是NK或T細胞在體外高劑量IL-2誘導(dǎo)下，獲得能殺傷NK抵抗的腫瘤細胞的功能，在過繼免疫治療腫瘤中已得到廣泛的應(yīng)用。通過將同位素51Cr

原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)檢測凋亡2018/08/08

（一）原理凋亡細胞是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活后，將DNA切割成許多雙鏈DNA段以及高分子量DNA單鏈斷裂點（缺口），暴露出大量3-羥基末端，如用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）將標記的dUTP進行缺口末端標記，則可原位特異地顯示出凋亡細胞。主要應(yīng)用的是熒光標記法和酶標記法。（二）熒光標記法1．材料與試劑采用德國Boehringer-Mannheim公司InSituCellDeathDetection試劑盒，或美國Oncor公司ApopTagTM試劑盒，包括：⑴生物素標記的-Dutp(Biotin

檢測細胞凋亡的實驗方法比較2018/08/08

TUNEL與ELISA檢測凋亡的方法比較TUNEL法細胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正

多酚氧化酶（PPO）的分離提取2018/08/07

一、原理與目的多酚氧化酶是植物組織內(nèi)廣泛存在的一種含銅氧化酶，植物受到機械損傷和病菌侵染后，PPO催化酚與O2氧化形成醌，是組織形成褐變，以便損傷恢復(fù)，防止或減少感染，提高抗病能力。醌類物質(zhì)對微生物有毒害作用，所以傷口醌類物質(zhì)出現(xiàn)是植物防止傷口感染的愈傷反應(yīng)，因而受傷組織一般這種酶的活性就會提高。多酚氧化酶也可與細胞內(nèi)其他底物氧化相偶聯(lián)，起到末端氧化酶的作用。PPO的存在是水果、蔬菜褐變及營養(yǎng)喪失的主要原因之一。PPO氧化內(nèi)源的酚類物質(zhì)生成鄰醌，鄰醌再相互聚合成醌或蛋白質(zhì)、氨基酸等作用生成高分子

細胞裂解液的制備2018/08/07

一、試劑準備1、新鮮配制冷的RIPA裂解緩沖液:150mMNaCL1%NP-40(去垢劑)0.1%SDS(去垢劑)2ug/mlAprotinin(蛋白酶抑制劑)(使用前加入)2ug/mlLeupeptin(蛋白酶抑制劑)(使用前加入)1mMPMSF(蛋白酶抑制劑)1.5mMEDTA(蛋白酶抑制劑)1mMNaVanadate(磷酸脂酶抑制劑)(任選)以上所有試劑均按比例溶于150mMNaCL溶液中。2、冷的PBS中加入1mMPMSF1.5mMEDTA1mMNaVanadate（釩酸鈉）(任選)3、

蛋白質(zhì)提取的好辦法2018/08/07

你試一試這兩種方法:種：1）將細胞系放在冰上2）去除上清，用pH7。4的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細胞兩次3）加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min4)刮下單層細胞，4度下10000g5min離心5）溶液37度水浴10min以分離水相和去污劑相，然后37度下2000g離心5min6)收集水相留作分析7）用500ul冰冷的bufferC溶解去污劑相沉淀，冰浴2min后加溫，在按步驟6再次離心8）按步驟8再次抽提去污劑相，用bufferC將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積9）用等量的bufferA

蛋白樣品的定量2018/08/07

目前常用比色法測定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍法）、Lowry法（Folin-酚試劑法）、BCA法等。但各有優(yōu)缺點，大家可以根據(jù)具體情況選取。按相應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大，大家可以根據(jù)具體情況選取。Bradford法（考馬斯亮藍法）:考馬斯亮藍G-250

放射免疫分析法的建立2018/08/06

一、放射免疫分析的基本試劑（一）標準品標準品是放射免疫分析法定量的依據(jù)，由于以標準品的量用來表示被涮物質(zhì)的量，故標準品與被測物質(zhì)應(yīng)當化學(xué)結(jié)構(gòu)一致并具有相同免疫活性。標準品作為定量的基準。應(yīng)要求高度純化。標準品除含量應(yīng)具有準確性外，還應(yīng)具備穩(wěn)定性，即在合理的貯存條件下保持原來的特性。按實驗要求，將標準品用緩沖液配成含不同劑量的標準溶液，用于制作標準曲線。（二）標記物標記抗原應(yīng)具備：①比放射性高，以保證方法的靈敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期盡可能長，標記一次可較長時間使用，這對來之不易的抗

原代細胞的培養(yǎng)與建系2018/08/02

原代細胞的培養(yǎng)與建系細胞的來源多樣，培養(yǎng)方法也各不相同，凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細胞稱之為原代細胞。原代細胞經(jīng)分散接種之手段稱為傳代。凡能經(jīng)傳代方式進行再次培養(yǎng)的細胞稱為傳代細胞。若能穩(wěn)定生長傳至10~20代以上的細胞可確立為細胞系。若有條件能開展單細胞克隆、純化，經(jīng)大量擴增后所形成的生物學(xué)特性穩(wěn)定的克隆化細胞群，稱之為細胞株或克隆細胞。此過程稱為細胞的純化或細胞克隆。這些基本技術(shù)是從事細胞培養(yǎng)工作的基礎(chǔ)，只有熟悉和掌握了基本技術(shù),才可能更快捷地學(xué)習(xí)和

無血清培養(yǎng)基2018/08/02

無血清培養(yǎng)基(serumfreemedium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的*培養(yǎng)基可以滿足大部分細胞培養(yǎng)的要求，但對有些實驗卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。無血清培養(yǎng)基的基本配方: