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2020
08-03

熒光PCR凍干保護劑之甘油
多元醇類凍干保護劑包括甘油、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、叔丁醇、側金盞花醇等，這一類凍干保護劑是比較常用較為普遍的凍干保護劑。以甘油作為凍干保護劑來介紹一下在蛋白質凍干中的作用。甘油具有良好的滲透能力，可以進入細胞內部和胞內大分子形成氫鍵以取代干燥脫除的水分，從而維持蛋白質、碳水化合物及脂肪等大分子活性物質的原有結構。此外，甘油還可以起到降低細胞脫水皺縮和緩解復水腫脹的效果。另外醇和糖類相似均具有醇和糖類羥基官能團，均能產生“優(yōu)先水化作用”以及改變體系的玻璃態(tài)轉變溫度等，故在發(fā)揮保護效果方面
2020
08-03

熒光PCR凍干之二糖
二糖又名雙糖,雙糖是碳水化合物的一種。它是由兩個單糖分子經縮合反應除去一個水分子而成的糖。例如乳糖由葡萄糖和半乳糖組成，蔗糖由葡萄糖和果糖組成，麥芽糖由兩個葡萄糖組成等。二糖作為常用的凍干保護劑，能夠有效增加蛋白凍干穩(wěn)定性，但是用它們作保護劑得到的無定形蛋白凍干固體具有較低的Tg，對儲存過程中的高溫和高濕條件耐受較差。大分子量糖能夠增加凍干后固體的Tg，增加凍干后穩(wěn)定性，但是對于低濃度蛋白活性保護作用不理想。例如蔗糖對蛋白質具有保護作用，葡聚糖在冷凍和干燥過程中不能防止蛋白質變性，而蔗糖與葡聚糖
2020
08-02

熒光PCR凍干之聚合物
聚合物又稱加聚物。由一種單體經聚合(加聚)反應而成的產物。分子具有重復的結構單位。包括晶態(tài)結構、非晶態(tài)結構、取向態(tài)結構以及織態(tài)結構。聚合物包括聚乙二醇、PVP、明膠、聚乙烯亞胺等。聚合物常用作為蛋白質的冷凍保護劑，通常聚合物的穩(wěn)定作用取決于聚合物的多重性質,如優(yōu)先從蛋白質表面析出、表面活性、使蛋白質溶液私度升高從而阻止其他小分子(如糖及多輕基化合物)的結晶、抑制冷凍過程中pH值的劇烈變化等。不同聚合度及濃度的聚合物所提供的保護作用不同,如聚合度大的PvP有著較高的玻璃化溫度,隨著PvP濃度及分子
2020
08-01

熒光PCR凍干之氨基酸
氨基酸是含有氨基和羧基的一類有機化合物的通稱。目前發(fā)現(xiàn)的天然氨基酸就有300多種，基本氨基酸也有二十個品鐘。氨基酸應用于食品行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、化妝品行業(yè)等。氨基酸是常見的蛋白質保護劑之一。在冷凍過程中,低濃度的甘氨酸可通過抑制10或100mmol/L磷酸緩沖鹽結晶所致pH值的改變而阻止蛋白質藥物變性。無定型甘氨酸可阻止凍干過程中重組人生長激素的聚集;結晶型甘氨酸能升高成品的塌陷溫度,阻止因塌陷而引起的蛋白質藥物的破壞。常用的氨基酸類蛋白質保護劑有脯氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸、苯丙氨酸、
2020
07-29

熒光PCR之探針法
熒光PCR的探針法分為全基因組核酸探針、克隆探針、寡核苷酸探針、單鏈RNA探針、cDNA探針、蛋白質探針以及酶探針。帶大家一起了解下寡核苷酸探針、cDNA探針、RNA探針的特點。寡核苷酸探針特異性較高，區(qū)別染色體上一個堿基的突變；由于其鏈短，分子量小，雜交時間較短（僅需1-2小時），可預測雜交條件，可直接利用DNA序列人工合成獲得特異片段而無需分子克隆，獲得探針相對容易。但是由于其鏈短致使標記率較低，也影響了檢測的敏感性，僅能檢出含很少的標本。cDNA探針以RNA為模板，用反轉錄酶合成單鏈cDN
2020
07-27

熒光PCR凍干之DMSO
二甲基亞砜（DMSO）是一種有機化合物，常溫下為無色無臭的透明液體，是一種吸濕性的可燃液體。具有高沸點、熱穩(wěn)定性好、與水混溶的特性。可作有機溶劑、反應介質和有機合成中間體。也可用作合成纖維的染色溶劑、去染劑、染色載體,以及回收乙炔、二氧化硫的吸收劑。二甲基亞砜是一種既溶于水又溶于有機溶劑。廣泛用作溶劑和反應試劑，具有很高的選擇抽提能力。二甲基亞砜是如何應用的呢？下面簡單介紹下，DMSO是一種重要的滲透型細胞保護劑。培養(yǎng)液中DMSO濃度為10%時，細胞生長抑制率近100%；1‰濃度時抑制率為35%
2020
07-26

熒光PCR凍干保護劑之甲酰胺
甲酰胺是一種化合物，無色透明液體，略有氨味，是合成醫(yī)藥、香料、染料等的原料，也可作為溶劑用于合成纖維的抽絲、塑料加工、木質酪素墨水的生產等。通過甲酸甲酯和氨的反應制備甲酰胺的方法。甲酰胺是可作為溶劑、有機合成原料、醫(yī)藥原料等的在工業(yè)上有用的物質。甲酰胺是被較早發(fā)現(xiàn)并應用的PCR凍干保護劑之一，能促進引物模板退火，能提高PCR反應的特異性。分享下熒光PCR試劑凍干的示例：(1)將熒光PCR擴增緩沖液、引物、探針、熱啟動Taq酶、UNG酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、凍干保護劑
2020
07-25

熒光PCR凍干之PVP
聚乙烯吡咯烷酮簡稱PVP,是一種非離子型高分子化合物，是N-乙烯基酰胺類聚合物中被研究得深、廣泛的精細化學品品種。應用于醫(yī)藥、化妝品、食品等行業(yè)。可做粘合劑、增溶劑、分散或共研磨劑、活性成分穩(wěn)定劑等。PVP按其平均分子量大小分為四級，用K值表示，K值實際上是與PVP水溶液的相對粘度有關的特征值，而粘度又是與高聚物分子量有關的物理量，一般K值越大，其粘度越大，粘接性越強。熒光PCR凍干時，PVP能夠增強PCR產物生成量，其中PVP也能有效提高PCR效率和特異性。PVP作為PCR增強劑時，應選用合適
2020
07-24

熒光PCR凍干保護劑之蔗糖
蔗糖是由葡萄糖和果糖通過異構體羥基縮合而成的非還原性二糖。蔗糖極易溶于水其溶解度隨著溫度的升高而增大。蔗糖的化學性質穩(wěn)定，多呈無定型結構，對阻止蛋白質二級結構改變、凍干處理過程中，貯藏期內蛋白質的伸展和聚集起重要的作用。糖對蛋白質保護作用大小有時和其濃度有關，通常在某個濃度范圍內糖的保護作用隨著濃度的升高而增大；當達到某一濃度時保護作用達到大值，而此后再增大糖的濃度則保護效果不再顯著增加，有時反而會降低。在凍干時，其中蔗糖海藻糖等雙糖對一些蛋白質均能顯示出良好的保護作用，具備多種保護特性，如高的
2020
07-23

熒光PCR凍干保護劑之海藻糖
海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種通過生物發(fā)酵技術從玉米、木薯等淀粉獲得的安全、可靠的天然糖類。海藻糖在食品以及醫(yī)藥生物制品方面等廣泛應用。海藻糖是怎么應用的呢？在食品中作為添加劑來改善干燥食品的質量和風味。在醫(yī)藥生物制品方面海藻糖因其具有高玻璃化轉變溫度和低吸濕性等特性，對實現(xiàn)蛋白等生物藥品的玻璃化凍結起重要作用，既是有效的低溫保護劑又是很好的凍干保護劑。海藻糖作為熒光PCR凍干保護劑的其中一種，在凍干中的應用：既能在冷凍過程中充當低溫保護劑，又能在干燥脫水過程中起到脫水保護劑的作用。由凍干保護
2020
07-21

熒光定量PCR的優(yōu)點
普及一下熒光定量PCR的幾個優(yōu)點：1、使用特異性探針對定量分子進行識別，具有很高的準確性。同時靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。2、熒光PCR檢測技術是綜合了PCR技術、熒光標記技術、激光技術、數碼顯象技術為一體的技術，因此檢測靈敏度高。3、熒光信號的產生和每次擴增產物成一一對應的關系，通過熒光信號的檢測可以直接對產物進行定量；定量范圍可在0－1010拷貝/毫升。4、擴增和檢測可以在同一管內檢測，一步完成，不需要開蓋，不易污染。5、速度快、高通量，可在2－3小時完成96個樣品的定量
2020
07-19

熒光PCR凍干保護劑-叔丁醇
叔丁醇被大家認為是適合制劑的凍干溶劑。有如下特點：凝固點高，純的叔丁醇在室溫下（25℃）就可以凍結。叔丁醇的蒸汽壓較高有利于升華，節(jié)省凍干時間。叔丁醇毒性低，在凍干過程中，大部分叔丁醇可在一次干燥階段升華，在制劑中殘留量很低。叔丁醇自身在凍結中形成針狀結晶，能改變溶質的結晶方式，利于升華。叔丁醇也可在熒光PCR試劑當凍干保護劑使用。叔丁醇起到加快凍干進程和改善凍干微觀結構的作用。凍干前的熒光PCR反應混合物原液中的濃度范圍為：叔丁醇的濃度為10%-40%（v/v）。熒光PCR凍干時，我們可以提供
2020
07-19

熒光PCR凍干保護劑篩選方法
熒光PCR凍干體系篩選范圍:糖類、醇類、氨基酸類、聚合物類、大分子蛋白、無機鹽類等，其組分為其中的幾種的組合。優(yōu)化方法：沒有經驗采用單一因素法，有一定經驗的采用多因素法。單一因素法篩選出保護效果比較好的保護劑，再將保護效果好的保護劑進行組合，產生終配方。因此，初步篩選采用單因素法，進一步篩選采用多因素法。我們不但能提供適合熒光PCR凍干的試劑凍干機Pilot10-15T，還能為用戶提供對藥品、診斷試劑、蛋白、多肽、酶、抗體、抗原等進行凍干工藝優(yōu)化，包括保護劑優(yōu)化、凍干曲線優(yōu)化、凍干生產工藝優(yōu)化。
2020
07-18

熒光定量PCR實驗時的好方法
實時熒光定量PCR技術實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，成為核酸分子定量的標準方法。在做熒光定量PCR實驗時建議使用這些耗材：96孔光學反應板配合光學膜，0.2ml光學八聯(lián)反應管配合光學膜，0.2ml光學八聯(lián)反應管配合平蓋的光學八聯(lián)管蓋等。在做熒光定量PCR實驗時有一些好的方法分享給大家，例如在使用單管或者8連管做實驗時，如果在樣本數量不多的時候，建議在樣品加熱塊（TRAY）上對稱的安放樣品，并且先放在第6列或者第7列，然后逐漸向兩邊放置
2020
07-17

實時定量PCR之定量
實時定量PCR不僅操作簡便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特異性。廣泛地運用于分子生物學的各個領域。實時定量PCR在應用中有一些使用人對定量的方法上覺得存在著不容易克服的問題主要包括1.定量的方法與眾多因素有關，如水、緩沖液、儀器性能等，乃至于核酸的抽提過程都會影響到結果的穩(wěn)定性。2.標準品的穩(wěn)定保存很難獲得成功，高濃度的核酸物質易于被降解，而每次配制新的標準品又會增加批間差異。3.每次測定樣本都要同時測定標準品，而熱循環(huán)儀的樣本孔有限，所以在單批內不能測定更多的樣本，這樣就使實時PCR的高通
2020
07-15

凍干熒光PCR試劑之反應管
凍干熒光PCR試劑凍干方法是將熒光PCR試劑經過預凍，在真空狀態(tài)下進行升華，后可制備成凍干粉。凍干熒光PCR試劑時，選用的反應管在做凍干時有許多不足之處：1.由于反應管呈上寬下窄的錐字形，還需要借助其他工具支撐，這樣反應管試劑與凍干機擱板的接觸面積很小，升華時傳熱會受到限制，延長了預凍和升華的時間，反應管中的凍干程序一般在24～30小時，凍干制品日產量很低。2.反應管中的凍干，在加入凍干混合試劑后，需要進行離心處理，排出氣泡，并將粘附在反應管壁上的試劑離心下來。3.反應管中的凍干，在凍干結束后需
2020
07-15

熒光定量PCR的效率值
熒光定量PCR的效率值可通過標準曲線獲取。理想的反應效率為100%。效率較高（高于110%）一般說明反應過程中存在抑制作用。引起抑制作用的原因主要是RAN或者DNA質量較差，模板濃度過高及含有核酸鈍化的殘余物。反應效率較低（低于90%）的原因有試劑濃度不適（主要是引物、鎂、Taq、DNA、聚合酶、尤其是在多重試驗中）。造成效率低的其他因素有引物Tm之間的差異超過5℃或者是熱循環(huán)條件不適。抑制作用和較低的效率會影響分析的靈敏度，導致動態(tài)范圍減小及通用性降低。怎樣解決呢？可在做凍干時降低模板濃度，優(yōu)
2020
07-14

淺談熒光PCR凍干芯片的方法
熒光PCR凍干芯片的制備方法簡單快速，易于操作，縮短凍干所需時間，一般可在八小時內完成凍干步驟。熒光PCR凍干芯片的制備方法示例,1.先要稱取制備凍干保護劑如海藻糖、棉子糖、右旋糖酐、甘油、焦磷酸二乙酯處理過的水，置于容器中混合均勻，然后加熱至*溶解，在放入2～8℃冷卻。2.預混熒光定量PCR試劑如將PCR反應緩沖液、引物、探針、dNTPs和DNA聚合酶混合均勻；將預混的熒光定量PCR試劑和凍干保護劑混合均勻（體積比為3:1），制備成凍干試劑；取5～8μL的凍干試劑點在微流控芯片的試劑凍干腔中，
2020
07-12

熒光探針和熒光染料凍干防護
凍干對熒光探針和熒光染料有防護作用，凍干可防止探針和染料降解，提高反應的靈敏度和特異性。接著介紹一下熒光探針和熒光染料的特性。熒光探針是PCR擴增時在加入一對引物的同時加入熒光探針，探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。熒光染料是在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料
2020
07-07

中試凍干機制品升華干燥要點
制品在凍干過程中的升華干燥，分為一次干燥和二次干燥。一次干燥的要點，當凍干箱內的壓力降到60Pa（根據制品特點而定）以下，就可以給制品加熱，為制品升華提供能量，制品升華的速度由加熱能力和冷阱的捕水能力而定。但凍干箱的壓力必須維持在允許的高壓力以下，板層的溫度在一次升華不要超過共溶點?？梢酝ㄟ^以下現(xiàn)象斷定一階段干燥結束：1.干燥層和凍結層的交界面到達瓶底并消失。2.產品溫度上升到接近板層的溫度。3.凍干箱的壓力且維持不變。上述現(xiàn)象發(fā)生后，至少再延長0.5~1小時，以*除制品中的殘留冰晶，既可轉入二

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