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細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)2021/10/29: 簡(jiǎn)介一.細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理細(xì)胞培養(yǎng)是用酶消化法將組織碎塊分離成單個(gè)細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，在體外適宜條件下，使細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，并保留其一定的結(jié)構(gòu)和功能特性。細(xì)胞培養(yǎng)與組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)主要不同點(diǎn)在于原始培養(yǎng)的對(duì)象不同。細(xì)胞培養(yǎng)使用的是單個(gè)細(xì)胞懸液，組織培養(yǎng)使用的是組織塊(0．5～1立方毫米)或薄片(厚0．2毫米)，而器官培養(yǎng)使用的是器官原基或器官的一部分或整個(gè)器官。在組織培養(yǎng)中，細(xì)胞自組織塊周圍移出并生長(zhǎng)，細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中總有移動(dòng)(運(yùn)動(dòng))或其它變動(dòng)，這樣就使被培養(yǎng)的組織難以長(zhǎng)期維持其原有的結(jié)構(gòu)

MDCK細(xì)胞培養(yǎng)2021/10/29: 簡(jiǎn)介一、目的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)是分離流感病毒及相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)。疾控中心的所有技術(shù)人員，必須按照本文件相關(guān)的操作規(guī)程進(jìn)行操作。二、適用范圍適用于疾控中心所有技術(shù)人員。三、程序（一）生物安全要求實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別：BSL-1所有操作必須在BSL-1實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜里進(jìn)行。材料與儀器二）材料1.生長(zhǎng)成片的MDCK細(xì)胞2.無菌的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶3.D-MEM培養(yǎng)液（含有L-谷氨酰胺）4.青、鏈霉素母液（10000U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸鏈霉素），分裝后保存于-20℃5.HEPE

病原微生物提取的方法有哪些？2021/10/26: 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球感染性疾病導(dǎo)致的患者死亡占全部死因的25%以上，在中國(guó)，感染性疾病占所有疾病的50%以上，75%造血系統(tǒng)腫瘤患者和50%實(shí)體腫瘤患者死于感染，膿毒癥（嚴(yán)重感染）患者病死率高達(dá)50%。而在面對(duì)疑難重癥時(shí)，快速檢測(cè)病原微生物變得刻不容緩。什么是病原微生物病原微生物是指侵犯入人體引起感染的微生物，或稱病原體。病原微生物包括病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲和朊毒體等。mNGS就是綜合分析來自患者樣本的病原微生物的基因物質(zhì)（DNA和RNA），實(shí)現(xiàn)病原種屬

雙重染色法免疫熒光組織化學(xué)染色步驟2021/10/26: 材料與儀器：原代培養(yǎng)胚胎14天大鼠端腦細(xì)胞，F(xiàn)ITC，TRITC實(shí)驗(yàn)步驟：雙重染色法免疫熒光組織化學(xué)染色步驟若在同一標(biāo)本中有兩A和B種抗原需要同時(shí)顯示，A抗原的抗體用FITC標(biāo)記，B抗原的抗體用TRITC標(biāo)記，可采用以下染色方法：免疫熒光細(xì)胞化學(xué)雙重染魚法原代培養(yǎng)胚胎14天大鼠端腦細(xì)胞：在骨發(fā)生形態(tài)蛋白―{誘導(dǎo)下，乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(呈綠色熒光)和同源域蛋白Islet―1(呈紅色熒光)共存于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(激光掃描共聚焦顯微鏡觀察)1．一步雙染色法先將兩種熒光標(biāo){己抗體按適當(dāng)比例混合(A+B)，按直接法進(jìn)

免疫熒光（Immunofluorescence, IF）實(shí)驗(yàn)方法2021/10/26: 材料與儀器：免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細(xì)胞儀）測(cè)定含量。實(shí)驗(yàn)步驟：免疫熒光實(shí)驗(yàn)的主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測(cè)等。細(xì)胞片制備（通俗的說法是細(xì)胞爬片）是免疫熒光實(shí)驗(yàn)的第一步，

免疫熒光技術(shù)-間接法2021/10/26: 材料與儀器：抗體PBS伊文氏蘭顯微鏡實(shí)驗(yàn)步驟：1.標(biāo)本固定后，PBS洗滌3x3分鐘；2.滴加一抗，37℃40分鐘或4℃過夜；3.PBS洗3x3分鐘；4.滴加熒光標(biāo)記二抗37℃，40分鐘；5.PBS洗3x3分鐘；6.0.1%伊文氏蘭復(fù)染；7.PBS洗3x3分鐘；8.緩沖甘油封片，鏡檢。要點(diǎn)：1.種屬在進(jìn)行雙重免疫標(biāo)記時(shí)，要選擇來源于兩種不同種屬動(dòng)物的一抗，如選擇來源于rabbit和mouse的抗體，二抗則用帶有不同熒光素標(biāo)記的，如抗rabbit或抗mouse二抗，F(xiàn)ITC和Tex-Red;2.孵育

免疫熒光技術(shù)-直接法2021/10/26: 材料與儀器：抗體PBS伊文氏蘭顯微鏡實(shí)驗(yàn)步驟：1.標(biāo)本經(jīng)固定后，PBS洗滌3×3分鐘；2.加熒光素標(biāo)記的抗體，濕盒內(nèi)37℃孵育50分鐘；3.PBS洗滌3×3分鐘；4.0.1%伊文氏蘭復(fù)染；5.PBS洗3次，蒸餾水洗2次，每次3分鐘，以除去NaCl結(jié)晶；6.緩沖甘油封片，鏡檢。要點(diǎn)：直接法比較簡(jiǎn)單，特異性也較高，但每種熒光抗體只能檢測(cè)一種相應(yīng)的抗原，應(yīng)用范圍較窄，敏感性也較低。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察、判斷與分析是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要環(huán)節(jié)，判斷結(jié)果的好與壞、真與假需注意以下幾點(diǎn)。1、必須設(shè)立對(duì)照染色（陰性或

冰凍切片和石蠟切片各自的優(yōu)劣之處是什么？2021/10/26: 冰凍切片和石蠟切片各自的優(yōu)劣之處1、從一抗的選擇方面來看。有的一抗既能做石蠟切片又能做冰凍切片，而有的一抗只能做冰凍切片，關(guān)鍵取決于所要檢測(cè)的抗原穩(wěn)定性，有的抗原不穩(wěn)定，經(jīng)過組織固定，脫水、透明、浸蠟、包埋、脫蠟等一系列的做石蠟切片的步驟，所檢測(cè)的抗原易被破壞，這時(shí)只能用冰凍切片來做，檢測(cè)這類抗原的一抗只能做冰凍切片，而那些穩(wěn)定的抗原，能經(jīng)受住石蠟切片的的考驗(yàn)，一般來講也可以用冰凍切片來做，總得來講，對(duì)于既可以用冰凍切片也可以用石蠟切片檢測(cè)的抗原，用石蠟切片檢測(cè)的染色效果要比冰凍切片好一些。2、

細(xì)胞不長(zhǎng)，這些方面您注意了嗎？2021/10/25: Q1培養(yǎng)液pH對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響？答：由于大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2-7.4，偏離此范圍可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)將產(chǎn)生有害的影響，目前也有些無血清培養(yǎng)基或者轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)基PH值會(huì)在6.5左右。因?yàn)楦鞣N細(xì)胞對(duì)pH的要求也不*相同，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對(duì)pH變動(dòng)耐受差，無限細(xì)胞系耐受力強(qiáng)。但總體來說，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強(qiáng)一些。在配制培養(yǎng)用液時(shí)，需要注意一點(diǎn)：培新配的培養(yǎng)基在經(jīng)過0.10um或0.22um濾膜過濾時(shí)，溶液的pH還會(huì)向上浮動(dòng)0.2左右Q2培養(yǎng)液pH下降很快可能原因有哪些？其解決方法是什么？答：通常細(xì)胞生

NGS建庫人都在用的文庫質(zhì)量評(píng)定方法，你都知道嗎？2021/10/25: 高通量測(cè)序（NextGenerationSequencing，NGS）近年來飛速發(fā)展，在各個(gè)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。而文庫的制備是NGS技術(shù)中極為重要的步驟。所謂文庫制備（LibraryPreparation）就是在DNA的片段兩端連接上特定序列的接頭的過程，讓文庫可以在高通量測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。文庫構(gòu)建的最終目的在于成功測(cè)序，并獲得序列信息。那么如何判定這個(gè)文庫能否上機(jī)測(cè)序呢？想必這是大家一致關(guān)注的問題。文庫的數(shù)量和質(zhì)量是能否成功測(cè)序的關(guān)鍵。文庫的濃度和文庫分布是評(píng)價(jià)文庫質(zhì)量的兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。文庫濃度

常見的DNA損傷類型有哪些？2021/10/25: 說起DNA損傷修復(fù)，相信大家都很熟悉，但小編今日還是要跟大家再嘮嘮這個(gè)話題，講講在二代建庫中，如果DNA存在損傷，那常見的損傷類型有哪些呢？而這些損傷又是如何進(jìn)行修復(fù)的呢？損傷的形成常見的DNA損傷有兩種，一種是由DNA復(fù)制中的錯(cuò)誤或DNA自發(fā)性的化學(xué)變化引起的自發(fā)性損傷，一種是由物理或化學(xué)等外界環(huán)境因素引起的被動(dòng)性損傷。這些損傷如果發(fā)生在活體中，會(huì)由機(jī)體進(jìn)行自發(fā)性修復(fù)，但如果損傷嚴(yán)重，不能*修復(fù)，長(zhǎng)時(shí)間則會(huì)引起機(jī)體老化或腫瘤等疾病的發(fā)生。在建庫過程中，我們遇到的DNA損傷多為外界環(huán)境引起的被動(dòng)

化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的原理2021/10/25: 背景介紹將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入細(xì)菌的過程稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化通常有兩種方法：化學(xué)轉(zhuǎn)化法和電穿孔法。電穿孔法的轉(zhuǎn)化率高達(dá)109～1010個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化率比化學(xué)轉(zhuǎn)化法高，當(dāng)可能得到的每一個(gè)克隆都非常重要時(shí)（如構(gòu)建cDNA文庫），就需要用電穿孔法。化學(xué)轉(zhuǎn)化法一般每微克DNA能獲得105～106個(gè)轉(zhuǎn)化子，可滿足常規(guī)的克隆實(shí)驗(yàn)需求，因此化學(xué)轉(zhuǎn)化法在克隆實(shí)驗(yàn)中是較為常用到的轉(zhuǎn)化方法?；瘜W(xué)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化步驟化學(xué)轉(zhuǎn)化法中用到的感受態(tài)細(xì)胞是化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞常用冰預(yù)冷的CaCl2處理細(xì)菌的方法來

ELISA雙抗體夾心法2021/10/22: 簡(jiǎn)介ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。材料與儀器（1）包被緩沖液（pH9.60.05M碳酸鹽緩沖液）（2）洗滌緩沖液（pH7.4，0.15MPBS）（3）稀釋液（4）終止液（2MH2SO4）（5）底物緩沖液（pH5.0）（6）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）使用液（7）2，2’-連氮基-雙-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液（8）

蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)方法原理步驟及注意事項(xiàng)2021/10/22: 蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot|WB）實(shí)驗(yàn)方法原理步驟及注意事項(xiàng)一：蛋白提取1、組織蛋白提取1）所需器材：制冰機(jī)、標(biāo)記筆、兩套1.5mlEP管（最好高溫高壓處理）、一個(gè)大冰盒、一個(gè)1.5mlEP管盒、手套、眼科剪（最好高溫高壓處理）、新鮮組織或保存于-80℃冰箱組織、保存于4℃冰箱的PBS（最好高溫高壓處理）、移液槍、吸頭（最好高溫高壓處理）、兩套研磨棒（最好高溫高壓處理）、掌上離心機(jī)、濾紙、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一種蛋白酶抑制劑，劇毒）、離心機(jī)、燒杯、2×SDS凝膠上樣

非基因組DNA的提取2021/10/22: 一、DNA提取方法簡(jiǎn)介1、基因組DNA的提取1.1、CTAB法1.2、SDS法1.3、其它2、非基因組DNA的提取2.1、質(zhì)粒DNA的提取2.1.1、堿裂解法2.1.2、煮沸法2.2、線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結(jié)合SDS裂解法2、非基因組DNA的提取2.1、質(zhì)粒DNA的提取2.1.1、堿裂解法l堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)

DNA提取方法簡(jiǎn)介2021/10/22: 一、DNA提取方法簡(jiǎn)介1、基因組DNA的提取1.1、CTAB法1.2、SDS法1.3、其它2、非基因組DNA的提取2.1、質(zhì)粒DNA的提取2.1.1、堿裂解法2.1.2、煮沸法2.2、線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結(jié)合SDS裂解法1、基因組DNA的提取1.2、SDS法SDS法原理SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/

核酸提取的方法2021/10/22: 核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作。核酸提取系列目錄一、DNA提取方法簡(jiǎn)介二、DNA提取常見問題、原因分析及其對(duì)策三、RNA提取方法簡(jiǎn)介四、RNA提取及其RT-PCR常見問題、原因分析及其對(duì)策一、DNA提取方法簡(jiǎn)介1、基因組DNA的提取1.1、CTAB法1.2、SDS法1.3、其它2、非基因組DNA的提取2.1、質(zhì)粒DNA的提取2.1.1、堿裂解法2.1.2、煮沸法2.2、線粒體、葉綠體DNA的提取差

Southern Blot DNA印跡雜交實(shí)驗(yàn)全流程2021/10/21: 一、DNA的提取人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA的分離通常是在有EDTA、Sarkosye等一類去污劑存在下，用蛋白酶K消化細(xì)胞，隨后用FEN、LVFANG抽提，經(jīng)RNase處理和純化來提取DNA。(1)取單層細(xì)胞，經(jīng)無鈣、鎂PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，細(xì)胞懸液經(jīng)PBS洗2次,棄上清，取細(xì)胞沉淀。(2)加入2ml細(xì)胞裂解液(10mMTrisHCL，pH8.0，0.1mol/LEDTA，10mmol/LNaCL，1%SDS)充分混勻，加入蛋白酶K至終濃度為0.5～1g/L、Sarkosye

如何確定實(shí)驗(yàn)室常用試劑的有效期？2021/10/21: 試劑的有效日期是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。在實(shí)際使用過程中，人們總是習(xí)慣于用生產(chǎn)日期來判斷化學(xué)試劑的有效性，其實(shí)這是不對(duì)的?；瘜W(xué)試劑不像食品和藥品有嚴(yán)格的保質(zhì)期，化學(xué)試劑一般沒有保質(zhì)期的具體要求和界限，這與化學(xué)試劑的保質(zhì)期受多方面因素影響有關(guān)。要根據(jù)化學(xué)性質(zhì)、保存條件等，再結(jié)合工作的實(shí)際情況判斷試劑是否出現(xiàn)變質(zhì)、能否繼續(xù)使用?；瘜W(xué)試劑一般沒有注明保質(zhì)期，確定試劑是否變質(zhì)主要是憑經(jīng)驗(yàn)和做新舊試劑對(duì)比試驗(yàn)。化學(xué)試劑的有效期隨著化學(xué)品的化學(xué)性質(zhì)的改變，有著很大的區(qū)別。一般情況下，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的物質(zhì)

帶你走近細(xì)胞生物學(xué)世界的第一步——細(xì)胞培養(yǎng)2021/10/21: 細(xì)胞培養(yǎng)的概念：細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件等），使之生存、生長(zhǎng)、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡(jiǎn)單的單細(xì)胞或極少分化的多細(xì)胞，通過細(xì)胞培養(yǎng)既可以獲得大量細(xì)胞，又可以借此研究細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的合成代謝、細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖等。細(xì)胞培養(yǎng)所需的儀器設(shè)備：倒置顯微鏡便于掌握細(xì)胞的生長(zhǎng)情況（細(xì)胞形態(tài)、大小、密度、結(jié)構(gòu)）并觀察有無污染

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