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兔源抗體2024/04/28: 兔IgG只有一種亞型人和小鼠都有五種抗體類型（IgA,IgD，IgE，IgG,andIgM）。目前為止，已經(jīng)在兔中發(fā)現(xiàn)其中的四種（IgA,IgE,IgG，andIgM）。有趣的是，人有兩種IgA亞型，小鼠有一種，而兔子共有14種IgA亞型。研究用的抗體主要是IgG類型。兔只有一種IgG亞型，而小鼠有IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3亞型，大鼠有IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG2c亞型。表一列出了兔抗體類型，亞型，基因名稱及導(dǎo)向NCBI和IMGT基因數(shù)據(jù)庫的鏈接。表一：

細(xì)胞計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟＆問題分析2024/04/25: 細(xì)胞計(jì)數(shù)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中是非常常見的，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室目前使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)如下圖所示：實(shí)驗(yàn)步驟1.所用細(xì)胞密度達(dá)到一定要求后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)鋪板，提前準(zhǔn)備好細(xì)胞計(jì)數(shù)板、蓋玻片、計(jì)數(shù)器；2.棄掉原有培養(yǎng)基，加入1ml溫浴的PBS緩沖液清洗；3.棄掉PBS緩沖液，加入胰酶消化細(xì)胞，消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類型及日常經(jīng)驗(yàn)決定；4.消化相應(yīng)時(shí)間后，加入二倍體積的培養(yǎng)基終止消化，用移液器將細(xì)胞全部吹下，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)；5.離心機(jī)室溫800rpm,離心5min；6.準(zhǔn)備和所計(jì)數(shù)細(xì)胞種類相同的1.5m

DMEM、1640、MEM...這么多培養(yǎng)基有什么不同？2024/04/24: 為什么細(xì)胞培養(yǎng)基有那么多不同的名字？常見的1640和DMEM有什么不同？培養(yǎng)基應(yīng)該如何儲(chǔ)存？這一期我們講講細(xì)胞培養(yǎng)所用到的培養(yǎng)基。01為什么細(xì)胞培養(yǎng)基有那么多不同的名字？培養(yǎng)基有很多不同的名字是因?yàn)楦鶕?jù)不同細(xì)胞的培養(yǎng)和應(yīng)用場(chǎng)景，培養(yǎng)基可以分為多種類型，最常見的是DMEM、RPMI-1640、MEM等。這些培養(yǎng)基有自己的配方特點(diǎn)和適用范圍。例如，DMEM適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，而RPMI-1640則適用于淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)。此外，還有一些專門用于特定類型細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，如神經(jīng)元培養(yǎng)基、肌肉細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟、技巧，Transwell or Millicell?2024/04/23: 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模貉芯績煞N或三種細(xì)胞之間的相互作用實(shí)驗(yàn)簡介：共培養(yǎng)是通過分別在插入式細(xì)胞培養(yǎng)小室內(nèi)外培養(yǎng)兩種或以上細(xì)胞，來研究細(xì)胞之間的相互作用，例如不同CD亞型的免疫細(xì)胞、免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞、飼養(yǎng)層和干細(xì)胞等。因此，在免疫、腫瘤、干細(xì)胞等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。方法11.將小室放在24孔板里，用培養(yǎng)基潤濕膜。2.反轉(zhuǎn)小室，底面朝上，加入約200μL細(xì)胞懸液，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-4小時(shí)，使細(xì)胞貼膜。3.輕輕將小室正立在培養(yǎng)板孔里，在小室里層種第二種細(xì)胞，并在小室里面和外面都加培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞貼膜

原位雜交實(shí)驗(yàn)流程2024/04/23: 原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)簡稱原位雜交，屬于固相分子雜交的范疇，它是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，在原位檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法。一、合成RNA探針1、設(shè)計(jì)探針引物RNA探針長度500bp最為合適。一輪引物不添加啟動(dòng)子序列，二輪引物在正向引物的5端加上T7啟動(dòng)子序列，在反向引物的5端加上SP6啟動(dòng)子序列。2、探針合成用未添加啟動(dòng)子序列的引物克隆出探針序列的DNA模板，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。膠回收，將其連接到T載體上，轉(zhuǎn)化涂板，進(jìn)行質(zhì)粒提取送測(cè)。用添加了T7和SP6啟動(dòng)子序列

如何提高DNA濃度/純度測(cè)定的準(zhǔn)確性？2024/04/23: 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常需要對(duì)樣品進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定，它相當(dāng)于一種質(zhì)控，以此來確保下游實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可靠。常用的DNA濃度/純度測(cè)定設(shè)備是紫外分光光度計(jì)，它的原理是利用物質(zhì)分子對(duì)紫外可見光譜區(qū)的輻射吸收來進(jìn)行分析物質(zhì)成分。這樣來描述可能有點(diǎn)生硬，我們舉個(gè)栗子：假設(shè)現(xiàn)在有一樣物質(zhì)A，它溶解在溶液內(nèi)，當(dāng)光照射溶液時(shí)，溶液內(nèi)的A會(huì)吸收一部分的光。不同顏色的光有不同的波長，A對(duì)不同顏色的光（不同波長）的吸收程度是不一樣的。雙鏈的DNA，它能對(duì)波長為260nm的光進(jìn)行強(qiáng)烈的吸收，吸收的程度可以用一個(gè)叫吸光度的數(shù)

Lipofectamine ™ RNAiMAX轉(zhuǎn)染2024/04/23: 轉(zhuǎn)染是實(shí)驗(yàn)過程中常用的技術(shù)操作，通俗來說，常見的轉(zhuǎn)染即為把某種功能性質(zhì)粒轉(zhuǎn)到細(xì)胞中去，通過轉(zhuǎn)染試劑的作用在經(jīng)過一段時(shí)間后，收集細(xì)胞通過WB、qpcr等來檢測(cè)質(zhì)粒是否正常發(fā)揮作用來達(dá)到我們實(shí)驗(yàn)的某種需求；不同的質(zhì)粒通常有不同的轉(zhuǎn)染試劑和不同的方法，如PEI轉(zhuǎn)染、lipo2000轉(zhuǎn)染等。Lipofectmine™RNAiMAX轉(zhuǎn)染主要供siRNA和Stealth™RNAi雙鏈體轉(zhuǎn)染使用，具有轉(zhuǎn)染效率高、對(duì)細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)，分為正向轉(zhuǎn)染及反向轉(zhuǎn)染兩種方式。siRNA轉(zhuǎn)染比較常見，因此本文分享主要針對(duì)s

原代細(xì)胞培養(yǎng)入門2024/04/22: 大家好！這篇文章是關(guān)于原代培養(yǎng)的入門知識(shí)，向剛?cè)腴T的同學(xué)科普這個(gè)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。包括以下內(nèi)容：原代培養(yǎng)的概念和流程分離組織的操作和注意事項(xiàng)解離組織獲取細(xì)胞的三種常見方法原代培養(yǎng)是指細(xì)胞分離之后至第一次傳代之前的細(xì)胞培養(yǎng)階段，之后細(xì)胞就轉(zhuǎn)變成細(xì)胞系。原代培養(yǎng)可分為4個(gè)步驟：獲取樣品分離組織解剖或解離組織接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)用于原代培養(yǎng)的樣品中可來源于2類，一是實(shí)驗(yàn)室樣本，包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的器官、組織，例如胚胎、腸道等；二是臨床樣本，例如通過手術(shù)過程分離出來的病人組織。分離組織分離組織的時(shí)候，要注意無菌操作，

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)常見問題分析2024/04/22: 流式細(xì)胞技術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種高效的方法，用于分析和收集細(xì)胞懸液中的單個(gè)細(xì)胞。FCM的優(yōu)勢(shì)在于其速度快、結(jié)果客觀，并且具有重要的統(tǒng)計(jì)意義。它能夠處理復(fù)雜的樣本，同時(shí)收集多個(gè)參數(shù)，其可靠性和重復(fù)性都非常出色。今天我將總結(jié)并分享一系列關(guān)于流式細(xì)胞技術(shù)的常見問題及其分析。對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)的原理和步驟不甚清晰的同學(xué)，建議先閱讀本公眾號(hào)以往的文章，了解背景知識(shí)。1.熒光抗體染色無信號(hào)或信號(hào)弱（1）加入的抗體量不足：這是普通的一種情況，只需要摸索實(shí)驗(yàn)條件，適當(dāng)增加抗體的量或濃度。

何時(shí)用瓶皿培養(yǎng)，何時(shí)用孔板培養(yǎng)2024/04/18: 細(xì)胞的體外培養(yǎng)需要依附在人工附著物上，大多數(shù)脊椎動(dòng)物細(xì)胞在人工附著物上會(huì)呈現(xiàn)為單層生長的狀態(tài)。所謂的人工附著物，就是常見的多孔板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿。用什么類型的附著物來培養(yǎng)細(xì)胞，是有什么依據(jù)的呢？這一期內(nèi)容就講講這個(gè)話題?；靖拍顝牟牧戏诸惿峡?，常見的細(xì)胞培養(yǎng)附著物分為一次性的塑料和玻璃。先說玻璃，成本低、可重復(fù)使用，透光性好，但由于其清洗過程復(fù)雜，不易保存，現(xiàn)在已逐漸被一次性塑料取代了。一次性塑料的主要成份是聚丙乙烯，由人工合成，質(zhì)地均勻，產(chǎn)量大成本低，能為細(xì)胞提供一個(gè)良好的生長表面。這里有一個(gè)

ELISA實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)2024/04/18: 前置知識(shí)ELISA（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）是一種常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，用于檢測(cè)和定量分析樣品中特定抗原或抗體的存在。ELISA是基于免疫學(xué)原理的一種高靈敏度和高特異性的實(shí)驗(yàn)方法。ELISA實(shí)驗(yàn)通常包括以下步驟：1.涂覆：將待檢測(cè)的抗原或抗體溶液加入到微孔板（通常是96孔板）中，并在孔板表面上形成一層固定的抗原或抗體。這個(gè)過程被稱為涂覆。2.阻斷：為了防止非特異性結(jié)合，需要在涂覆后加入一種阻斷劑，例如牛血清蛋白（BSA）或牛奶粉，以覆蓋孔板上未

要做好CCK-8實(shí)驗(yàn)，這三個(gè)重要環(huán)節(jié)請(qǐng)注意2024/04/17: 在做細(xì)胞基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必要的一步就是需要探究清楚細(xì)胞的增殖變化和毒性耐藥變化情況，為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。我們?cè)谧鯟CK-8增殖和毒性實(shí)驗(yàn)中常常會(huì)遇到一下幾個(gè)問題：1.細(xì)胞鋪板問題2.給CCK-8的方式問題3.CCK-8的反應(yīng)時(shí)間問題首先，在進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)，需要用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，得到細(xì)胞數(shù)量后按照所需鋪板的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行調(diào)整。一般96孔板鋪板數(shù)量為1*10^6/孔。制備細(xì)胞懸液時(shí)需要反復(fù)吹打，使細(xì)胞懸液充分混勻，降低出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)塊的幾率。一般96孔板，每孔加入100微升細(xì)胞懸液，從孔的9點(diǎn)鐘方向打

細(xì)胞凍存的實(shí)驗(yàn)步驟＆注意事項(xiàng)2024/04/17: 細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)用于保護(hù)細(xì)胞免受損傷，以便在需要的時(shí)候重新復(fù)蘇和使用，對(duì)于保存少有的細(xì)胞資源、制備細(xì)胞庫、研究細(xì)胞生物學(xué)等方面具有重要意義。實(shí)驗(yàn)步驟：1.細(xì)胞凍存液提前配置：凍存液配置比例根據(jù)實(shí)驗(yàn)習(xí)慣即可，若細(xì)胞不多或使用人數(shù)較少，建議一次少量配置，配置完成后，由于DMSO的存在，因此需要嚴(yán)格避光保存。2.需要凍存的細(xì)胞密度要求≥90%，鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度滿足要求后，棄掉原有培養(yǎng)基，沿培養(yǎng)皿邊緣加入1ml溫浴的PBS緩沖液清洗。3.棄掉PBS緩沖液，加入胰酶消化細(xì)胞，消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類型決定。

三羧酸循環(huán)與銅死亡2024/04/15: 銅死亡背景2022年3月在Science期刊發(fā)表的CopperinducescelldeathbytargetinglipoylatedTCAcycleproteins揭示了銅離子過載會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)失衡，銅離子直接結(jié)合三羧酸循環(huán)酯?；鞍?，F(xiàn)DX1/LIAS介導(dǎo)的LApathway（硫辛酸途徑）誘導(dǎo)硫辛酸化修飾的DLAT（丙酮酸脫氫酶復(fù)合物關(guān)鍵組分）發(fā)生寡聚化，從而使三羧酸循環(huán)代謝失常，引發(fā)細(xì)胞蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。該研究表明，銅死亡與三羧酸循環(huán)代謝途徑是有直接聯(lián)系的。圖1.

細(xì)胞消化和傳代經(jīng)驗(yàn)分享2024/04/10: 一、準(zhǔn)備工作試劑準(zhǔn)備：培養(yǎng)細(xì)胞所需的培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清（簡稱FBS）、雙抗（簡稱P/S）、PBS緩沖液等從4°C的冰箱中取出，于室溫條件下放置至恢復(fù)室溫。耗材準(zhǔn)備：50ml離心管、15ml離心管及移液槍。實(shí)驗(yàn)條件準(zhǔn)備：打開超凈臺(tái)紫外線照射30min之后通風(fēng)3-5min即可開始實(shí)驗(yàn)。二、實(shí)驗(yàn)步驟1.潔凈要求：進(jìn)入細(xì)胞間后，穿好實(shí)驗(yàn)服，戴好口罩手套等實(shí)驗(yàn)裝備，將上述試劑耗材用酒精噴洗后放入超凈臺(tái)，手部同樣酒精噴洗后放入超凈臺(tái)，手部同樣酒精噴洗即可開始。2.試劑分裝及配制：（1）配制（血清）細(xì)胞培

CHO-K1倉鼠卵巢細(xì)胞株的培養(yǎng)方法2024/04/10: 中國倉鼠卵巢（Chinesehamsterovary,CHO）細(xì)胞是第一個(gè)被美國FDA、歐盟EMA和中國CFDA認(rèn)可的用于生物制藥領(lǐng)域的生產(chǎn)細(xì)胞，已廣泛應(yīng)用于各種治療性蛋白質(zhì)藥物的大規(guī)模制備，包括重組抗體、重組單體蛋白質(zhì)以及重組融合蛋白質(zhì)等。CHO-K1是未經(jīng)改造的野生型CHO細(xì)胞。最原始的CHO-K1細(xì)胞是貼壁培養(yǎng)，并需要添加血清，由于血清的批間穩(wěn)定性問題，及后來病毒安全性問題，無血清懸浮培養(yǎng)成為趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)室常以貼壁的CHOK1細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。細(xì)胞形態(tài)：長梭形（10×倍鏡）培養(yǎng)條件：DME

Dot blot法鑒定分泌型蛋白表達(dá)2024/04/10: 實(shí)驗(yàn)原理：Dotblot是一種半定量的蛋白質(zhì)或核酸檢測(cè)方法，其原理是將待測(cè)物直接滴于固相載體上，然后通過特異性抗體或探針與待測(cè)物結(jié)合，最終通過可視化方法來檢測(cè)目標(biāo)分子的存在與否。溶液配置：操作步驟：（1）減取適當(dāng)大小的PVDF膜，于甲醇活化1分鐘；（2）將活化后的PVDF膜于ddH2O中，在脫色搖床上清洗15分鐘；（3）提取預(yù)冷離心機(jī)，將樣品在4℃低溫條件下8000rpm離心15分鐘，取上清作為樣品（分泌型蛋白）。（4）取出活化后的PVDF膜在室溫晾至半干，看見水膜消失即可。將收集的上清、空白對(duì)

小鼠脾臟native CD4+ T細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)2024/04/09: 在生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞培養(yǎng)是基礎(chǔ)中的基礎(chǔ)，大部分實(shí)驗(yàn)只需要用到相關(guān)細(xì)胞系的培養(yǎng)，但對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物原代細(xì)胞的培養(yǎng)也是非常重要的。脾臟T細(xì)胞的分離和培養(yǎng)就是免疫學(xué)領(lǐng)域的一種非?；A(chǔ)和重要實(shí)驗(yàn)方法。本文將詳細(xì)探討小鼠脾臟T細(xì)胞分離培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟，幫助大家更有效地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶崛⌒∈笃⑴K的naiveCD4+T細(xì)胞，研究某種因素對(duì)naiveCD4+T細(xì)胞或某一亞型的CD4+T細(xì)胞增殖分化和功能狀態(tài)的影響，或者在誘導(dǎo)分化為CD4+T細(xì)胞的某一亞型后做下游實(shí)驗(yàn)。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容小鼠脾臟naiveCD4+

馬松染色的實(shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)2024/04/01: 馬松（Masson）染色是一種用于可視化組織纖維和炎性因子的染色方法。該技術(shù)充分利用了不同組織成分對(duì)陰離子燃料滲透性的差異。此法多用于觀察病變組織中纖維結(jié)締組織的增生和分布,纖維素腫瘤與肌源性腫瘤的鑒別，在肌肉疾病和心血管疾病的診斷中具有重要意義。一、原理：Masson染色，又成為馬松染色，是結(jié)締組織染色領(lǐng)域中經(jīng)典的一種技術(shù)方法，專注于膠原纖維的染色。該方法被廣泛應(yīng)用于組織學(xué)研究中，其主要目的是對(duì)胞核進(jìn)行染色，并能夠有選擇地展示膠原纖維和肌纖維。Masson染色的原理與陰離子染料分子的大小以及對(duì)

Caco2細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)分享2024/04/01: 背景介紹Caco2細(xì)胞是常見的結(jié)腸腺癌細(xì)胞，正常情況下，Caco2細(xì)胞在培養(yǎng)的過程中貼壁生長，其形態(tài)多為多邊形或梭形，增殖速度較快，其鏡下形態(tài)如下圖所示，密度已大于90%，可以進(jìn)行傳代。圖：Caco2細(xì)胞形態(tài)培養(yǎng)方法1.培養(yǎng)基配置：DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素鏈霉素雙抗+1%谷氨酰氨。2.其余需要準(zhǔn)備的試劑耗材包括：無菌PBS、胰酶、無菌槍頭、細(xì)胞培養(yǎng)皿、15ml離心管、離心機(jī)、生物安全柜、水浴鍋、75%酒精。3.培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。4.細(xì)胞復(fù)蘇：提前將水

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