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細胞轉染技術2022/05/19

一、細胞轉染細胞轉染是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術。常規(guī)轉染技術可分為瞬時轉染和穩(wěn)定轉染兩大類。本實驗室主要是質粒轉染、miRcroRNA轉染、慢病毒轉染、藥物轉染、多肽轉染等。二、miRcroRNA轉染（一）實驗材料及試劑六孔板、CO2培養(yǎng)箱、EP管、酒精燈等；無血清培養(yǎng)基、MEM-α或DMEM、RNA、lipofectamine2000、MSC細胞等。（二）實驗內容1當六孔板中MSC細胞密度達90％時，準備轉染，將無血清培養(yǎng)基、MEM-α或DMEM取出復溫并注意平衡好；2

流式細胞術檢測細胞周期2022/05/19

流式細胞術檢測細胞周期1。實驗原理用流式細胞儀檢測細胞周期，通常用碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染細胞核。PI在一定波長的光下發(fā)出熒光，其強度與DNA含量成正比。通過流式細胞儀分析各時期的細胞百分數，可檢測細胞的增殖、凋亡。2。流式細胞儀檢測A549細胞周期步驟收集對數生長期細胞，計數，以(1~5)×105/孔接種于6孔板，置37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。次日更換培養(yǎng)液，各孔分別加入含有0、80、400、2000、10000mg/L不同濃度茶氨酸的細胞培養(yǎng)液2m

人胃癌高轉移模型2022/05/16

人胃癌高轉移模型的建立可以：（1）研究腫瘤轉移機制；（2）研究腫瘤防治；（3）為腫瘤轉移研究提供更為理想的動物模型。腫瘤組織塊原位移植法實驗方法原理用人胃癌組織塊SGC-7901原位移植于SCID小鼠，第4周末移植瘤向淋巴結和肝臟等器官轉移，轉移率達66.7%(2/3)，第6周末轉移率高達*(10/10)。實驗材料雄性SPF級SCID小鼠人胃癌組織SGC-7901試劑、試劑盒水合氯醛福爾馬林液儀器、耗材飼養(yǎng)籠光學顯微鏡石蠟實驗步驟一、實驗材料準備1.雄性SPF級SCID小鼠，6～7周齡，體重20

一般慢性炎癥的基本病理變化2022/05/14

1、炎癥灶內主要是巨噬細胞、淋巴細胞和漿細胞浸潤。單核吞噬細胞的浸潤對慢性炎癥十分重要。單核細胞從血管游出后轉化為巨噬細胞。巨噬細胞還可被激活。在炎癥灶局部巨噬細胞的積聚有三方面的原因：①由于從炎癥灶不斷產生吸引單核細胞的趨化因子，如C5a、纖維蛋白多肽、陽離子蛋白質及膠原和纖維粘連蛋白的分解產物等。因此，從血液循環(huán)中滲出的單核細胞源源不斷來到局部，這是局部巨噬細胞的主要來源。②游出的巨噬細胞在局部通過有絲分裂而增殖，但巨噬細胞局部增殖的起始動因還不清楚。③炎癥灶內的巨噬細胞壽命長，并能長期停留

激光掃描共聚焦顯微鏡操作步驟及注意事項2022/05/14

激光掃描共聚焦顯微鏡可測定的樣品種類很多．包括生物材料、組織(切片)、細胞(亞細胞)結構等。樣品中熒光的來源主要有如下幾種：自發(fā)熒光(autofluorescence)、熒光染色、免疫熒光、熒光蛋白、誘發(fā)熒光(inducedfluorescence)及酶致熒光(enzymaticallyproducedfluorescence)等等。其中大部分熒光素的激發(fā)和發(fā)射波長均可在儀器自帶軟件的染料信息庫中找到。1．觀察步驟及儀器操作根據實驗要求制備樣品完畢后。即可進行觀察。基本步驟如下：(1)開啟儀器電

人非小細胞肺癌裸鼠原位種植轉移模型的建立實驗2022/05/14

人非小細胞肺癌裸鼠原位種植轉移模型的建立：（1）探討肺癌遠處轉移和阻斷其遠處轉移的研究；（2）模擬晚期非小細胞肺癌轉移的自然發(fā)生過程；（3）在活體動物的完整器官內評估瘤細胞播散和腫瘤的生長。實驗方法原理將表達GFP的質粒pRNAT-U6/Neo轉染人肺腺癌細胞A549，G418篩選獲得穩(wěn)定表達GFP細胞，對比轉染前后細胞的生長活性和成瘤性。將轉染后細胞原位種植裸鼠預定標準處死。HE染色和免疫組化檢測轉移灶的位置和數目。利用KODAKIS2000MM系統(tǒng)檢測腫瘤播散情況。實驗材料BALBcnunu

人胰腺癌裸小鼠模型2022/05/14

人胰腺癌裸小鼠模型實驗方法原理將人胰腺癌細胞株8988接種于裸鼠腋窩處皮下，每周測量腫瘤大小，第42d處死小鼠。腫瘤組織及相關臟器送病理及電鏡檢查，放射免疫法檢測相關抗原。皮下腫瘤組織細胞及細胞株培養(yǎng)，HE染色。實驗材料裸小鼠BALBcnu-nu胰腺癌細胞株8988試劑、試劑盒RPMI-1640*培養(yǎng)基胰酶戊二醛儀器、耗材CO2培養(yǎng)箱試管實驗步驟一、實驗材料準備裸小鼠BALB/cnu-nu，4～6周齡，體重16～20g，雌雄兼?zhèn)?，SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，恒溫25～27℃，恒濕45%～50%，飲用水及

懸浮細胞的免疫熒光標記實驗2022/05/07

免疫熒光標記技術（immunofluorescencetechnique）是將已知的抗體或抗原分子標記上熒光素，當與其相對應的抗原或抗體起反應時，在形成的復合物上就帶有一定量的熒光素，在熒光顯微鏡下就可以看見發(fā)出熒光的抗原抗體結合部位，檢測出抗原或抗體。實驗材料懸浮細胞試劑、試劑盒多聚-L-賴氨酸儀器、耗材離心機培養(yǎng)箱實驗步驟1.細胞在冰浴中冷卻，然后用臺式離心機于4℃以800g離心5min，吸去培養(yǎng)液并以4℃PBS重懸細胞。2.離心吸去PBS，以1~2ml2%PFA固定液，或2%PFA固定液/

成年小鼠的灌流實驗2022/04/30

進行實驗動物灌流是獲得良好的形態(tài)學觀察結果以及保存腦、腎、心臟和其他許多器官所必需的。對于未經訓練的實驗人員，初次進行灌流可能會失敗，故建議首先用一些對照實驗動物練習，以熟悉此過程?；痉桨笇嶒灢牧闲∈笤噭⒃噭┖蠵BS儀器、耗材23-G針頭注射管解剖器械實驗步驟1.一支針管吸滿1×PBS，另一支吸4%PFA固定液（4℃），擱置待用。2.在袋中用CO2氣體處死小鼠。停止吸呼后，立刻背朝下放平小鼠，小心剖開胸腔防止過多出血，小心并迅速切開肋骨，剪去橫隔膜，暴露心臟。3.小心將吸有1×PBS的針管刺

實驗動物的取血標準操作規(guī)程(SOP)2022/04/30

名稱：實驗動物的取血關鍵詞：動物,取血,方法目的：規(guī)范實驗動物(家兔、狗，豚鼠)取血的方法和途徑,主體內容：（一）家兔1．耳緣靜脈取血法選好耳緣靜脈，拔去被毛，用二甲苯或酒精涂擦局部，小血管夾夾緊耳根部，使血管充血擴張。術者持粗針頭從耳尖部血管，逆回流方向刺入靜脈內取血，或用刀片切開靜脈，血液自動流出，取血后棉球壓迫止血，取血量2～3ml。壓住側支靜脈，血液更容易流出；取血前耳緣部涂擦液體石蠟，可防止血液凝固。2．耳中央動脈取血法家兔固定箱內，用手揉擦耳部，使中央動脈擴張。左手固定兔耳，右手持注

藥物半數致死量LD50的測定實驗2022/04/30

實驗方法原理藥物半數致死量LD50是指藥物急性毒性實驗中，當動物死亡率為50%時的單次給藥劑量，單位通常為mg/kg。例如，當某藥物給予400mg劑量時，可致使一半家兔（體重約為4kg）死亡，則其LD50值為100mg/kg。LD50值通常反映藥物急性毒性的大小。藥物的急性毒性、慢性毒性實驗同屬于一般毒理學的研究范疇。此外，藥物毒理學研究尚包括特殊毒理學（致癌、致畸、致突變）、藥物依賴性及過敏反應實驗等。各種屬動物均可用于藥物LD50值的測定，通常使用嚙齒類動物（大鼠和小鼠），有時使用家兔和犬。

實驗性胃潰瘍模型的建立與防治2022/04/30

【實驗目的】1.學習大鼠胃潰瘍(gastriculcer)模型建立的方法。2．觀察藥物對實驗性胃潰瘍的防治作用。3．了解組織切片和HE染色方法?！緦嶒炘怼肯詽?pepticulcer)是由多種因素引起的一種常見病。正常情況下，機體有胃黏液、胃黏膜屏障（mucosalbarrier）、黏膜細胞更新以及胃、十二指腸節(jié)律性運動功能等一系列保護性機理，使胃、腸黏膜不受損傷。但過度的精神緊張、情緒激動，會使神經系統(tǒng)和內分泌功能紊亂；飲食失調，如粗糙食物，骨刺等對黏膜的物理性損害；刺激性食物，如過酸

實時熒光定量PCRrealtime PCR2022/04/30

實驗材料細胞樣品試劑、試劑盒RNA提取試劑盒熒光定量PCRMixTRIZOLdNTP氯仿逆轉錄酶MMLV異丙醇Taq酶DEPC水ddH2OTEMgCl2瓊脂糖溴化乙錠MOPS甲醛乙酸鈉EDTAEB溴酚蘭儀器、耗材離心管離心機風光光度計電泳槽凝膠板RealtimePCR儀一、樣品RNA的抽提1.取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。2.兩相分離每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離

ELISA 實驗常見問題解析2022/04/23

ELISA實驗因靈敏度高，特異性強在生物科研上得到了廣泛的認可，但對初學者而言，如不注意實驗操作過程中的各個環(huán)節(jié)，可能會對最終的實驗結果產生比較大的影響，比如實驗出現白板，顯色弱靈敏度低，花板無梯度背景高等現象。下面對以上實驗現象進行一一解析。1.白板現象在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標板中所有孔的顏色均為無色，即無信號呈現。出現該現象的可能原因：試劑已過保質期，不同批次稀釋液交叉使用。錯加漏加檢測A，檢測B或者底物溶液TMB。洗板或者加樣過程中，酶標記物被污染失活，稀釋液中含有

吉姆薩染色實驗2022/04/23

吉姆薩染液由天青，伊紅組成。染色原理和結果與瑞特染色法基本相同。但本法對細胞核和寄生蟲著色較好，結構顯示更清晰，而胞質和中性顆粒則著色較差?；痉桨笇嶒灢牧显浑s交玻片試劑、試劑盒吉姆薩染色液磷酸鈉緩沖液乙醇二甲苯儀器、耗材染色盤培養(yǎng)箱濾紙實驗步驟1.將顯影的玻片置于玻片架上，浸入盛有水的染色盤中。（1）1個盤：pH6.810mmol/l磷酸鈉緩沖液，所配的25倍稀釋的吉姆薩染液。（2）3個盤：水。（3）脫水系列溶液：①3個盤：分別盛50%、70%和95%乙醇。②2個盤：盛有100%乙醇。③3個

蛋白質檢測2022/04/23

蛋白提取組織樣本總蛋白提取（小鼠肝組織）1、頸椎脫臼處死小鼠，75%乙醇擦拭皮膚，剪開腹腔，剪切肝臟組織。2、平皿中放入6ml預冷0.9%NaCL。3、稱取0.6g左右肝組織，在平皿中剪碎組織，并轉移到勻漿器。4、預冷裂解液中添加PMSF（20ug/2ml）。5、取2ml預冷裂解緩沖液，迅速加入勻漿器，冰浴條件下充分研磨。6、組織研磨液轉移至1.5ml離心管。7、4℃，15000rpm，離心10min。8、取上清組織蛋白粗提取液至新的1.5ml離心管。9、進行蛋白定量，-80℃保存。蛋白提取組織

細胞免疫組化2022/04/23

1.對于貼壁細胞或細胞涂片PBS洗滌一次。2.如果細胞貼得不牢，可以干燥樣品使細胞貼得更牢。3.用4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，用PBS洗滌一次。4.將切片移入濕盒中加入新鮮配制的3%雙氧水,以去除內源性過氧化物酶封閉液，室溫孵育10分鐘，PBS充分淋洗；5.滴加正常山羊血清封閉液，室溫30分鐘，甩去多余液體；6.滴加一抗工作液，37℃孵育2h（或4℃過夜），然后PBS充分淋洗；7.滴加兔/鼠二抗工作液，室溫孵育1h，PBS充分淋洗；8.DAB顯色5-10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；9.PBS

western blot 之發(fā)光鑒定2022/04/23

一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。1．HRP-ECL發(fā)光法：將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒，根據所見熒光強度曝光。取出膠片立即*浸入顯影液中1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片*定影，清水沖凈晾干，標定Marker，進行分析與掃描。2．AP-NBT/BICP顯色法：每片N

楊梅苷對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護作用2022/04/17

目的：研究楊梅苷對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護作用及其機制。方法：60只SD大鼠隨機分為6組:正常對照組、模型組、陽性給藥組(維拉帕米100μg/L)和楊梅苷低中高劑量組(2.5,5,10mg/L),每組10只。釆用Langendorff離體心臟灌流技術,停灌30min,再灌45min,造成心肌缺血再灌注損傷模型。記錄楊梅苷對心臟血流動力學指標的影響,測定冠脈流出液中心肌三酶LDH、CK、AST的水平,心肌組織中抗氧化酶SOD、CAT的活性及脂質過氧化物MDA的含量。HE染色觀察心肌組織病理

辛伐他汀不同干預方案對骨質疏松大鼠骨質量的影響2022/04/17

目的：探討和比較不同干預方案下辛伐他汀對去卵巢大鼠骨丟失和骨質量下降的干預效果。方法：3月齡雌性SD大鼠32只,隨機分為4組,每組8只:假手術(A)組、卵巢切除(B)組、卵巢切除加辛伐他汀前半程干預組(C)和后半程干預組(D)。除A組接受假手術外,其余各組大鼠行雙側卵巢切除術,C組于術后給予辛伐他汀(5mg/kg/d)干預10周后停藥,D組于術后10周開始接受辛伐他汀干預。術后20周處死所有大鼠,采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清I型前膠原氨基端前肽(PINP)、I型膠原羧基端交聯端肽