HPLC如何檢測蛋白質(zhì)純度？原理與操作流程全解析檢測技術(shù)服務(wù)詳情介紹

dànbáizhì純度是影響下游實(shí)驗(yàn)可靠性和產(chǎn)品質(zhì)量的核心指標(biāo)。高效液相色譜（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）以其zhuóyuè的分離能力和定量精度，成為蛋白純度檢測的重要手段。本文將解析HPLC檢測dànbáizhì純度的原理、操作流程及優(yōu)化策略。

一、HPLC檢測dànbáizhì純度的原理

HPLC利用固定相與流動相間的相互作用差異，將樣品中不同組分分離，進(jìn)而定量分析目標(biāo)蛋白的純度。根據(jù)蛋白的理化特性，常用HPLC方法包括：

1、尺寸排阻色譜（SEC）

• 原理：通過多孔填料對dànbáizhì分子的排阻作用實(shí)現(xiàn)分離。分子量較大的組分先洗脫，較小組分后洗脫。

• 應(yīng)用：適用于檢測蛋白聚集體、降解產(chǎn)物等高分子雜質(zhì)。

2、反相色譜（RP-HPLC）

• 原理：依賴蛋白疏水性與固定相（如C18柱）間的疏水作用力分離。疏水性較強(qiáng)的組分與固定相結(jié)合更緊密，延遲洗脫。

• 應(yīng)用：用于分析蛋白純度、結(jié)構(gòu)完整性，特別對疏水區(qū)結(jié)構(gòu)變化敏感。

3、離子交換色譜（IEX）

• 原理：基于蛋白表面電荷與帶相反電荷的固定相（陽離子或陰離子交換劑）間的靜電相互作用實(shí)現(xiàn)分離。通過調(diào)節(jié)流動相中鹽濃度或pH梯度，分離不同電荷異構(gòu)體。

• 應(yīng)用：適合檢測蛋白的電荷異質(zhì)性及雜質(zhì)含量。

二、dànbáizhì純度HPLC檢測的標(biāo)準(zhǔn)操作流程

1、樣品準(zhǔn)備

• 將蛋白樣品溶解于適當(dāng)緩沖液（如PBS），確保wánquán溶解。

• 采用0.22 μm過濾器除去微粒，防止堵塞色譜柱。

• 控制進(jìn)樣濃度在系統(tǒng)建議范圍（通常為0.1–5 mg/mL），避免柱過載。

2、色譜系統(tǒng)準(zhǔn)備與條件設(shè)定

• 根據(jù)目標(biāo)蛋白選擇合適的色譜柱（SEC、RP、IEX）。

• 配制并過濾流動相，確保與樣品及柱兼容，防止析出物堵塞系統(tǒng)。

• 設(shè)定流速、柱溫（通常為25–40℃）及檢測波長（常用280 nm）。

3、系統(tǒng)平衡與樣品進(jìn)樣

• 使用流動相平衡色譜系統(tǒng)（約10–30分鐘），確?；€穩(wěn)定。

• 采用自動進(jìn)樣或手動進(jìn)樣，注意進(jìn)樣體積的jīngzhǔn控制。

4、洗脫及檢測

• SEC通常采用等度洗脫，保持流動相組成恒定。

• RP-HPLC和IEX多采用線性或階梯梯度洗脫，提高分辨率。

• 通過紫外檢測器（UV）監(jiān)控洗脫峰，繪制色譜圖。

5、數(shù)據(jù)分析與純度計算

• 提取色譜圖中主峰（目標(biāo)蛋白）及雜質(zhì)峰面積，計算純度百分比。通用公式：純度（%） = （主峰面積 ÷ 所有峰面積總和） × 100

• 為確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠，建議進(jìn)行多次進(jìn)樣，并結(jié)合自動積分與峰識別功能分析。

三、提高檢測準(zhǔn)確性的關(guān)鍵要點(diǎn)

• 合理選擇色譜柱：依據(jù)蛋白的分子量、疏水性或電荷特性，選擇匹配的分離模式。

• 優(yōu)化流動相組成：保證流動相的pH、鹽濃度與蛋白穩(wěn)定性相容，減少樣品降解或非特異性結(jié)合。

• 系統(tǒng)維護(hù)與柱保護(hù)：定期清洗流路和色譜柱，避免殘留物污染影響分析結(jié)果。

• 梯度洗脫策略：對于復(fù)雜樣品，可通過優(yōu)化梯度條件實(shí)現(xiàn)更高分辨率分離。

• 定量結(jié)果驗(yàn)證：通過多次獨(dú)立進(jìn)樣、使用外標(biāo)或內(nèi)標(biāo)法驗(yàn)證數(shù)據(jù)穩(wěn)定性與準(zhǔn)確度。

HPLC以其高分辨率、良好重復(fù)性和高靈敏度，已成為dànbáizhì純度檢測bùkěhuòquē的核心技術(shù)。深入理解其原理與操作流程，合理選擇色譜模式并優(yōu)化參數(shù)，是確保實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。百泰派克生物科技憑借優(yōu)良的色譜分析平臺和經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)團(tuán)隊(duì)，能夠提供從方法開發(fā)、系統(tǒng)搭建到數(shù)據(jù)解析的一體化解決方案。我們結(jié)合高分辨率分離技術(shù)與嚴(yán)格質(zhì)量控制體系，為科研人員與企業(yè)客戶提供高質(zhì)量、可重復(fù)、數(shù)據(jù)可追溯的蛋白純度檢測服務(wù)。

百泰派克生物科技特色項(xiàng)目

一、蛋白測序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀及島津公司埃德曼降解測序系統(tǒng)對dànbáizhì序列進(jìn)行分析，提供基于質(zhì)譜的蛋白測序分析服務(wù)，包括對dànbáizhì的氨基酸組成分析，Nduāncèxù，Cduāncèxù和全序列分析，以及基于埃德曼降解的dànbáizhìN端序列分析服務(wù)。對于未知理論序列的dànbáizhì，提供基于從頭測序法的dànbáizhì從頭測序服務(wù)，對蛋白序列進(jìn)行分析。

※服務(wù)優(yōu)勢：

1.采用目前世界上優(yōu)良的質(zhì)譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實(shí)現(xiàn)對所測定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測定蛋白N端多達(dá) 70個氨基酸序列;

4.可測定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測;

6.測序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響。

二、dànbáizhì組學(xué)

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜平臺結(jié)合Nano-LC，提供定量dànbáizhì組學(xué)、bǎxiàngdàn白zhìzǔxué、多肽組學(xué)、翻譯后修飾蛋白組學(xué)等多種dànbáizhì組學(xué)分析服務(wù)。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4Ddànbáizhì組學(xué)服務(wù)，助力微量樣本蛋白組學(xué)、大樣本群醫(yī)學(xué)及高通量修飾組學(xué)等研究工作。

※服務(wù)優(yōu)勢：

1 .高通量定量蛋白分析:多對照組大規(guī)模實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物;

2.體內(nèi)體外多種dànbáizhì標(biāo)記方法，適用于分析組織、細(xì)胞、血液等多種樣品;

3.質(zhì)譜分析靈敏度高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)度高;

4.可檢測較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.zhuānyè生物信息學(xué)分析，分析更系統(tǒng)準(zhǔn)確。

三、單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質(zhì)譜流式系統(tǒng)進(jìn)行單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析，采用金屬元素標(biāo)記物（通常是金屬元素標(biāo)記的特異抗體）標(biāo)記細(xì)胞表面和內(nèi)部的分子，然后用流式細(xì)胞原理分離單個細(xì)胞，再用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析單個細(xì)胞的原子質(zhì)量譜，zuì后將原子質(zhì)量譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號分子表達(dá)量。

※服務(wù)優(yōu)勢：

1.技術(shù)優(yōu)良，*技術(shù)空白

采用金屬標(biāo)記抗體技術(shù)，避免了傳統(tǒng)流式熒光通道少且易相互影響的問題?？稍趩渭?xì)胞層面上對多種指標(biāo)同時進(jìn)行表征，百泰派克生物科技可做到同時檢測51個目標(biāo)蛋白。

2.分析數(shù)量大，成本較低

單細(xì)胞RNAseq受成本等因素限制，所有樣本細(xì)胞匯總的分析數(shù)目一般在2x10^4個左右，而流式質(zhì)譜技術(shù)一次（單樣本）就可分析至少10^5的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了數(shù)量級的提高，且成本不高于單細(xì)胞RNAseq。

3.應(yīng)用前景大

①流式質(zhì)譜結(jié)果可以給出細(xì)胞亞群的變化，在臨床診斷、疾病機(jī)制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標(biāo)簽技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合會有新應(yīng)用方向。除常規(guī)蛋白外，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測細(xì)胞存活率、細(xì)胞大小、mRNA轉(zhuǎn)錄子表達(dá)量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)

百泰派克生物科技的基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實(shí)現(xiàn)10,000個以上I型多肽和10,000個以上II型多肽的鑒定和識別。通過我們優(yōu)化的高通量免疫多肽組學(xué)分析平臺進(jìn)行免疫肽組學(xué)分析，可從zuì小的樣品材料中進(jìn)行可重復(fù)的識別和定量。該服務(wù)可以應(yīng)用于大規(guī)模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案，深入挖掘未知的靶標(biāo)。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，MALDI TOF，高效色譜分離技術(shù)，提供一系列完善的生物藥物分析方案，從dànbáizhì、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級結(jié)構(gòu)分析，到產(chǎn)品變異性和純度分析。旨在提供優(yōu)質(zhì)生物藥物分析服務(wù)，幫助生物醫(yī)藥生產(chǎn)商提高生物藥物品質(zhì)。

百泰派克生物科技七大檢測平臺

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質(zhì)譜多組學(xué)優(yōu)質(zhì)服務(wù)商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫(yī)療器械行業(yè)提供質(zhì)量控制檢測和項(xiàng)目驗(yàn)證等zhuānyè服務(wù)。公司實(shí)驗(yàn)室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規(guī)和指導(dǎo)原則，通過CNAS/ISO9001雙重質(zhì)量體系認(rèn)證，建立了完備的質(zhì)量體系，數(shù)據(jù)冷熱/異地備份，設(shè)備定期計量/期間核查，軟件審計追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術(shù)服務(wù)，支持新藥研發(fā)、藥物申報注冊和生產(chǎn)放行。

1.公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系，zhuānyè提供以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的CRO檢測分析服務(wù)；

2.獲國家CNAS實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可，為客戶提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質(zhì)量研究服務(wù)；

3.業(yè)務(wù)范圍覆蓋dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、代謝組學(xué)、生物藥物表征、單細(xì)胞分析、單細(xì)胞質(zhì)譜流式、生信云分析以及多組學(xué)生物質(zhì)譜整合分析等；

4.七大質(zhì)量控制檢測平臺，滿足您一站式服務(wù)需求；

5.服務(wù)3000+企業(yè)，10000+客戶的選擇；

6.致力于為您提供優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)譜分析服務(wù)!

HPLC如何檢測蛋白質(zhì)純度？原理與操作流程全解析檢測技術(shù)服務(wù)詳情介紹