一区二区三区日本在线观看,偷窥间谍隐 tube

2018
03-20

重組蛋白分離純化的方法策略及案例介紹
分離純化處于重組蛋白表達(dá)的下游處理（downstreamprocessing）階段，且與上游過程緊密相聯(lián)，如是否帶有親和標(biāo)簽，是否進(jìn)行分泌表達(dá)等。所以在對(duì)目的蛋白表達(dá)純化時(shí)，要統(tǒng)一考慮和整體設(shè)計(jì)，并充分考慮上游對(duì)下游的影響。同時(shí)，不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法也影響下游的處理過程：目的蛋白表達(dá)是否形成包涵體，目的蛋白表達(dá)定位（胞內(nèi)、細(xì)胞膜內(nèi)、周質(zhì)空間和細(xì)胞外）由上表可知選擇將所表達(dá)的蛋白分泌到細(xì)胞外或周質(zhì)空間可避免破碎細(xì)胞的步驟，而且細(xì)胞外和周質(zhì)空間內(nèi)的蛋白種類較少，目的蛋白易純化；而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)重
2018
03-20

包涵體復(fù)性注意事項(xiàng)和常見問題解析
包涵體復(fù)性注意事項(xiàng)1)zui適pH值范圍為8.0-9.0之間；2)溫度適宜選擇4℃；3)復(fù)性過程蛋白濃度不宜過大，一般為0.1-0.2mg/mL；4)復(fù)性時(shí)間一般為24-36小時(shí)；5)低分子化合物如L-Arg有助于增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度；脲、鹽酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進(jìn)劑，都可阻止蛋白聚集；Tris對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用；EDTA可以防止蛋白降解；6)首先要獲得較高純度的包涵體；7)包涵體溶解要*，一般應(yīng)使溶解液體量較大，不要怕蛋白被稀釋，要有助溶措施；8)透
2018
03-19

原核表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)問題解析
1、外源DNA片段成功插到載體里面（PCR鑒定），但無法表達(dá)蛋白一般判斷目的基因是否表達(dá)，首先要進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。跑膠的時(shí)候一定要設(shè)對(duì)照：Marker，標(biāo)準(zhǔn)品陽性對(duì)照，以及空白載體(誘導(dǎo))和重組載體(不誘導(dǎo))2個(gè)陰性對(duì)照，再加上誘導(dǎo)不同時(shí)間的表達(dá)結(jié)果。跑SDS-PAGE的話可以用考馬斯亮蘭染，它靈敏度在100ng左右；但是不能跟著做westernblot了。銀染的靈敏度在0.1～1ng；或是SyproRed，靈敏度高還可以繼續(xù)做Westernblot。在做過WesternBlot仍沒有檢
2018
03-19

鎳柱純化常見問題及分析
1:通過His標(biāo)簽純化的蛋白，雜帶比較多，如何改進(jìn)？（1）如果純化的是上清，蛋白酶會(huì)部分降解目的蛋白，可通過加多種入蛋白酶抑制劑改進(jìn)。（2）可提高雜蛋白與鎳柱結(jié)合起始咪唑濃度，以降低雜蛋白與鎳柱的親和力。（3）雜蛋白和目的蛋白結(jié)合，可通過超聲前加入去垢劑的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。2:鎳柱使用中出現(xiàn)棕色是怎么回事?(1)出現(xiàn)這樣的情況，主要是緩沖液中DTT的影響，DTT會(huì)對(duì)鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響,在堿性的緩沖液條件下，鎳離子會(huì)被DTT還原生成棕色的沉淀，所以所有鎳柱
2018
03-16

多聚組氨酸標(biāo)簽（His-tag）
固定化金屬離子親合層析(Immobilizedmetalionaffinitychromatography,IMAC)，簡(jiǎn)稱金屬螯合親合層析，是一種新型的應(yīng)用于原核蛋白純化的技術(shù)。該方法通過蛋白質(zhì)表面的一些特殊的氨基酸，使之與金屬離子發(fā)生相互作用，從而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行親和純化。這些作用包括配價(jià)鍵結(jié)合、靜電吸附、共價(jià)鍵結(jié)合等，其中以6個(gè)組氨酸殘基組合的融合標(biāo)簽（His-Tag）在原核蛋白表達(dá)中的應(yīng)用zui為顯著。His-Tag可結(jié)合在目的蛋白的C末端或N末端，形成特殊的結(jié)構(gòu)，以便于進(jìn)行下一步的純化及檢
2018
03-16

蛋白質(zhì)純化分離-材料的預(yù)處理
蛋白質(zhì)在分子生物學(xué)中的分類，大體上可分為天然蛋白和重組蛋白。提取天然蛋白和構(gòu)建重組蛋白都需要先確定生物原材料，如植物材料主要以植物的葉，胚，果實(shí)和根莖等為主；動(dòng)物通常是選用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的器官和組織；而微生物則是微生物菌體本身或發(fā)酵液。從原則上講，任何一種自然界中存在或不存在的蛋白質(zhì)都可以被外源表達(dá)出來，像原核蛋白表達(dá)就是以大腸桿菌（E.coli）為宿主菌表達(dá)克隆基因，在原核表達(dá)體系中，重組蛋白的含量比雜蛋白的含量高的多，所以選擇和設(shè)計(jì)合適的分離純化方案對(duì)于重組蛋白表達(dá)純化的下游實(shí)驗(yàn)就顯得尤為重要。在
2018
03-15

蛋白純化方法—凝膠過濾色譜
基本原理凝膠過濾色譜蛋白純化法，又稱為空間排阻色譜，分子篩等。其原理是應(yīng)用蛋白質(zhì)分子量或分子形狀的差異來分離。當(dāng)樣品從色譜柱的頂端向下運(yùn)動(dòng)時(shí)，大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒從而被迅速洗脫；而較小的蛋白質(zhì)分子能夠進(jìn)入凝膠顆粒中，且進(jìn)入凝膠的蛋白在凝膠中保留時(shí)間也不同，分子量越大，流出時(shí)間就越早，zui終分離分子大小不同的蛋白質(zhì)。通常，多數(shù)凝膠基質(zhì)是化學(xué)交聯(lián)的聚合物分子制備的，交聯(lián)程度決定凝膠顆粒的孔徑。常用的色譜基質(zhì)有：葡聚糖凝膠（Sephadex）、瓊脂糖凝膠（Sepharose）、聚丙烯酰氨凝
2018
03-15

免疫印跡（Western Blot）的基本原理、實(shí)驗(yàn)步驟
WesternBlot原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。SDS-PAGE可對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到固相載體——例如硝酸纖維素薄膜（NC）上。固相載體可以吸附蛋白質(zhì)，并保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。轉(zhuǎn)移后的NC膜就稱為一個(gè)印跡（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脫脂奶粉溶液）處理，封閉NC膜上的疏水結(jié)合位點(diǎn)。用目標(biāo)蛋白的抗體（一抗）處理NC膜——只有待研究的蛋白質(zhì)才能與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，這
2018
03-14

Trizol法提取RNA實(shí)驗(yàn)步驟
一、分離純化的基本原理研究基因的表達(dá)和調(diào)控時(shí)常常要從組織和細(xì)胞中分離和純化RNA。RNA質(zhì)量的高低常常影響cDNA庫，RT-PCR和NorthernBlot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。二、試劑和材料無水乙醇、氯fang、Glycogen（可能需要）、1.5mlEppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）三、準(zhǔn)備工作RNase酶非常穩(wěn)定，是導(dǎo)致RNA降解zui主要的物
2018
03-13

紫外分光光度法測(cè)定水中的NO3-—N
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、鞏固紫外--可見分光光度法理論知識(shí)。2、掌握國(guó)產(chǎn)紫外分光光度計(jì)的基本構(gòu)成及使用方法。3、掌握廢水中NO3-—N的紫外分光光度法測(cè)定方法二、概述1、方法原理利用硝酸根離子在220nm波長(zhǎng)處的吸收而定量測(cè)定硝酸鹽氮。溶解的有機(jī)物在220nm處也會(huì)有吸收，而硝酸根離子在275nm處沒有吸收。因此，在275nm處作另一次測(cè)量，以校正硝酸鹽氮值。因此，硝酸根離子在220nm波長(zhǎng)處的校正吸收值為△A=A220–2A275。2、干擾及消除溶解的有機(jī)物、表面活性劑、亞硝酸鹽、六價(jià)鉻、溴化物、碳酸
2018
03-13

冷原子吸收光譜法測(cè)定汞離子
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、鞏固原子吸收光譜分析法理論知識(shí)。2、掌握測(cè)汞儀的基本構(gòu)成及使用方法。3、掌握水中汞離子的冷原子吸收測(cè)定方法。二、概述1、方法原理儀器根據(jù)原子吸收光譜分析的原理即汞子對(duì)波長(zhǎng)為253.7nrn的共振線上有強(qiáng)烈吸收作用制造的。吸收的大小與汞原子蒸汽的濃度的關(guān)系符合比耳定律。A＝lg1/T=lgI0/I=KCL式中：A一吸光度I一透射光強(qiáng)度C一汞蒸汽濃度T一透光率I0一入射光強(qiáng)度K一消光系數(shù)L一吸收光程的長(zhǎng)度由于汞的沸點(diǎn)很低容易揮發(fā)，同時(shí)汞離子能定量地被亞錫離子還原為金屬汞，因而在常溫下
2018
03-12

免疫組化常用方法介紹
1、定義用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）技術(shù)。2、原理根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原先和一抗結(jié)合，再利用一抗與標(biāo)記生物素、熒光素等的二抗進(jìn)行反應(yīng)，前者再用標(biāo)記辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如鏈霉親和素等）結(jié)合，zui后通過呈色反應(yīng)或熒光來顯示
2018
03-09

TA克隆原理及方法
一、PCR產(chǎn)物的T載體克?。ㄒ唬┲亟MT質(zhì)粒的構(gòu)建一．原理外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA分
2018
03-09

單抗制備流程
1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開創(chuàng)了新紀(jì)元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。制備單克隆抗體包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測(cè)抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個(gè)月的一系列實(shí)驗(yàn)步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實(shí)驗(yàn)方法。一、細(xì)胞融合前準(zhǔn)備(一)免疫方案選擇
2018
03-08

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)常用定量方法介紹
蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是生物體內(nèi)重要的共價(jià)修飾方式之一。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆過程幾乎調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活動(dòng)、肌肉收縮及腫瘤發(fā)生等過程在內(nèi)的所有生命活動(dòng)。目前已知有許多人類疾病是由于某些異常的磷酸化修飾所引起，而有些磷酸化修飾卻是某種疾病所導(dǎo)致的后果。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生命周期中，大約有1/3的蛋白質(zhì)發(fā)生過磷酸化修飾；在脊椎動(dòng)物基因組中，有5%的基因編碼的蛋白質(zhì)是參與磷酸化和去磷酸化過程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修飾本身所具有的簡(jiǎn)單、靈活、可逆的特
2018
03-08

Fish探針標(biāo)記方法大全
1、DNA的缺口平移法缺口平移是一種快速、簡(jiǎn)便、成本相對(duì)較低以及生產(chǎn)高比活性均一標(biāo)記DNA的方法。該技術(shù)可以制備序列特異的探針。當(dāng)使用重組質(zhì)粒探針時(shí)，雖然任何形式的雙鏈DNA都可以進(jìn)行缺口平移標(biāo)記。但通常使用限制性核酸內(nèi)切酶將插入片段進(jìn)行酶切和凝膠電泳純化后再進(jìn)行缺口平移標(biāo)記。此外，用這種探針進(jìn)行雜交可產(chǎn)生較低的背景信號(hào)。2、DNA的隨機(jī)引物法這種方法是使用寡核苷酸引物和大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段來標(biāo)記DNApian段。這種方法可代替缺口平移產(chǎn)生均一的標(biāo)記探針外，還在許多方面優(yōu)于缺
2018
03-07

GST融合蛋白純化常見問題解答
一、GST融合蛋白GST（谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶）能特異的與谷胱甘肽結(jié)合，表現(xiàn)為酶和底物的作用原理，利用這個(gè)原理，將GST做成標(biāo)簽表達(dá)出融合蛋白，與帶谷胱甘肽配基的親和介質(zhì)特異性結(jié)合，從而純化出目標(biāo)蛋白，GST融合蛋白純化的特點(diǎn)有：純度高、純化條件溫和保持蛋白活性、促進(jìn)蛋白可溶性表達(dá)等。二、GST蛋白結(jié)合效率太低1.可能原因：上樣流速太快，結(jié)合時(shí)間太短解決方案：GST親和層析是利用GST(glutathione-S-transferase)融合蛋白與固定的谷胱甘肽(GSH)通過硫鍵共價(jià)親和結(jié)合，GST與
2018
03-07

SNP分型原理及方法介紹
1、技術(shù)原理首先通過PCR擴(kuò)增含有SNP的基因[1]組片段，然后通過序列特異性引物實(shí)現(xiàn)單堿基延伸，隨后樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后在真空管中受瞬時(shí)納秒(10-9s)強(qiáng)激光激發(fā)。核酸分子因此解吸附成為單電荷離子，由于電場(chǎng)中離子飛行時(shí)間與離子質(zhì)量成反比，通過檢測(cè)核酸分子在真空管中的飛行時(shí)間而獲得樣品分析物的分子量，從而檢測(cè)出SNP位點(diǎn)信息。2、主要特點(diǎn)時(shí)間飛行質(zhì)譜（MALDI-TOF）完成的SNP檢測(cè)準(zhǔn)確率可達(dá)99.9%，除了準(zhǔn)確性高、靈活性強(qiáng)、通量大、檢測(cè)周期短等優(yōu)勢(shì)外，zui有吸引力的應(yīng)該還是它
2018
03-06

什么是抗體片段和抗體片段化
抗體片段化，就是用工具（蛋白酶及化學(xué)物質(zhì)）將抗體分子切成特定大小的片段。Why？因?yàn)樵趯?shí)際運(yùn)用時(shí)，抗體分子真的太大了！抗體分子的分子量一般為幾百道爾頓（例如IgM五聚體就更龐大了），分子直徑在10nm~15nm之間，而制備成抗體片段后，就呈現(xiàn)出各自的優(yōu)勢(shì)?？贵w片段特性及功能抗體片段化后，因去掉了某些功能結(jié)構(gòu)域以及分子量的改變，具有與全長(zhǎng)抗體不同的特性：1、顯著降低Fc的非特異性結(jié)合；2、沉淀和免疫印跡中可降低抗體與proteinA、proteinG的結(jié)合；3、更好的組織滲透性，免疫組化實(shí)驗(yàn)中染色
2018
03-06

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中的常見問題及其解決方法
本文匯總了流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中常見問題（無法標(biāo)記、PE抗體檢測(cè)不到但FITC可檢測(cè)到、非特異性染色、熒光強(qiáng)度弱、散射光信號(hào)異常、結(jié)果與預(yù)期相反等），并給出了各種可能的原因以及對(duì)應(yīng)的解決方法，希望對(duì)您實(shí)驗(yàn)有所幫助。一、細(xì)胞無法標(biāo)記1．確保所有的抗體都按照廠商的說明書正確存儲(chǔ)。2．確保商品化抗體沒有超過有效期。3．確保已正確加入足量的抗體。4．確保抗體已連接熒光素。如果未連接熒光素，需加入連接有熒光素的二抗。5．確保二抗是好的，也就是說二抗曾經(jīng)能與另外的一抗成功結(jié)合。6．確保使用了正確的二抗，就是說二抗

16 17 18 19 20 共32頁640條記錄

国产精品视频一区二区三区四,亚洲av美洲av综合av,99国内精品久久久久久久,欧美电影一区二区三区电影

上海希言科學(xué)儀器有限公司

提示