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小鼠MSC細胞的提取操作2023/01/04

MMSC細胞一般采用，長骨解剖和骨髓分離程序，總體目標是快速、系統(tǒng)地取出長骨，并收集骨髓細胞進行進一步的實驗分析。這種方法有助于回答有關骨髓生物學、腫瘤轉移和免疫學的關鍵問題。這項技術的主要優(yōu)點是解剖過程快速、標準化，骨髓分離程序相當無菌，首先處死小鼠并將小鼠置于仰臥位。然后將小鼠的四個爪墊固定在踝關節(jié)下方，用70%乙醇噴灑小鼠，徹-底沖洗腿部。下一步，在臀部正上方的下腹部中線右側做一個小切口，將切口向下延伸到腿部，穿過踝關節(jié)。拉回皮膚。然后切開固定在股骨近端的股四頭肌，露出大腿骨的前側，并用銷

毒王蝙蝠是怎么作為病毒宿主的？2023/01/03

以及目前流行的2019冠狀病毒病。值得注意的是，所有這些暴發(fā)都與蝙蝠傳播的病毒有關。蝙蝠是會飛的哺乳動物，它還有一些哺乳動物*的額外特征，比如相對于體型而言，較長的壽命，較低的腫瘤發(fā)生率，以及在宿主病毒不表現出臨床疾病的特殊能力。最近的研究表明，6400萬年的適應性進化塑造了蝙蝠的宿主防御系統(tǒng)，以平衡防御和耐受性，這導致了作為病毒理想宿主的能力。截至2020年12月21日，由嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起的covid-19大流行已導致超過75,704,857例病例和

配制培養(yǎng)基時，葡萄糖和谷氨酰氨的使用2023/01/03

葡萄糖在生物學領域具有重要地位，是活細胞的能量來源和新陳代謝中間產物，為生物的主要供能物質，所以在培養(yǎng)細胞中，一般的細胞都會選擇高糖的培養(yǎng)基來促進細胞體外生長。在目前常用的培養(yǎng)基中，葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養(yǎng)動物細胞的主要能源，其能量代謝通路與體內完-全不同，表現為葡萄糖主要經糖酵解途徑為細胞提供能量，谷胺酰胺大部分通過不完-全氧化途徑，另一小部分通過完-全氧化為細胞供能。因此，他們能調整細胞內的代謝途徑，促進細胞的快速生長和產物合成，同時可減少代謝抑制物的生成。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間

細胞消化步驟2022/12/16

養(yǎng)過細胞的小伙伴們肯定都知道，細胞養(yǎng)得好不好就看細胞傳代是的操作手法好不好了。因為懸浮細胞是可以不用消化直接離心收集沉淀就好，基本沒有操作難度。所以今天我們主要來聊一聊貼壁生長的細胞的傳代操作方法。貼壁生長的細胞當在培養(yǎng)瓶內長成致密的單層后，由于繼續(xù)生長的空間不足，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多，同時代謝廢物也會增多時，即細胞密度長到80%-90%時，則說明需要對細胞進行傳代操作來分瓶培養(yǎng)或者凍存處理。實驗室時內最-常用的傳代方法是胰酶消化法。一般細胞系和較常見的原代細胞都可以使用胰酶消化法來進行

細胞的STR鑒定2022/12/16

做實驗的時候才發(fā)現細胞的種類太多，于是我們需要查詢各種文獻看每個細胞的特征，從而設計實驗規(guī)劃與步鄹，我們在緊湊的實驗種完-美了實驗，提交文章的時候，才發(fā)現，需要細胞鑒定。據統(tǒng)計約30%細胞系被交叉污染或錯誤辨識,因使用了交叉污染或錯誤辨識的細胞而導致研究結論錯誤、結果不可重復、臨床細胞治療災難性后果……這浪費大量時間、精力和金錢。因此NIH、ATCC等權-威機構多次發(fā)出呼吁，要求研究者對細胞進行鑒定，最近美媒報道1/6科學家在研究使用“假-冒”細胞，2014年12月、2015年2月Science

血管形成實驗容易出現的BUG2022/12/16

血管生長是腫瘤發(fā)生的關鍵步驟。通過抑制腫瘤血管生成來阻止腫瘤發(fā)展和轉移合乎邏輯。血管生成(angiogenesis)是生殖、生長發(fā)育和修復的基礎。腫瘤無新生血管時,直徑很少超過2mm-3mm,其生長處于休眠狀態(tài)。當腫瘤原發(fā)灶或轉移灶長大到一定程度,氧及營養(yǎng)供應和代謝產物的排出就出現不足。一旦血管長入腫瘤,供給腫瘤組織營養(yǎng)和氧的方式由周邊彌散變成血液灌注,其代謝產物也能在血液循環(huán)時徹-底清除。腫瘤血管不僅為腫瘤提供營養(yǎng)和氧,運走代謝產物,還決定腫瘤的病理生理、生長、侵襲、轉移和對各種治療的反應。該

貼壁細胞的消化方法2022/12/16

如何消化讓細胞生長的更好，養(yǎng)細胞關鍵還是在消化，以下介紹幾種細胞的消化方法一、酶消化法1、胰酶，這是用得最多的。一般濃度在0.25-0.5%。消化的時間根據細胞種類、操作手法，溫度等因素而變化，從幾分鐘到幾十分鐘不等。0.25%的胰酶，37℃一般在消化單層貼壁的細胞一般1-5分鐘就足夠了，用血清或者含血清的完-全培養(yǎng)基終止。2、膠原酶，一般用于原代細胞消化，這種方法作用溫和，對細胞損傷較小，消化的時間也略長，不推薦的原因是膠原酶有點小貴而且培養(yǎng)細胞株感覺沒有多大的必要。二、離子螯合劑不破壞細胞表

染料排斥法測定細胞生存力實驗2022/12/16

原理萘黑、臺盼藍以及很多其他染料[KahenbachetaL1958]均不能透過活細胞。將細胞懸液與染料混勻，在低倍顯微鏡下檢査。材料與儀器胰蛋白酶巴斯德吸管顯微鏡手執(zhí)計數器生存力染料血細胞計數板步驟材料無菌受試細胞，如胰蛋白酶消化的貼壁細胞、融化冷凍的細胞或原代離散的細胞合適的生長液20ml0.25%胰蛋白酶5mlD-PBSA10ml非滅菌血細胞計數板生存力染料1ml(如用D-PBSA或HBSS配制的0.4%臺盼藍或1%萘黑）巴斯德吸管顯微鏡手執(zhí)計數器操作步驟1.用胰蛋白酶消化或離心與重懸，制

淋巴細胞的分離2022/12/16

原理通過右旋糖酐促沉降作用去除紅血細胞后，將枸櫞酸或肝素抗凝的全血或血漿層加在致密的Ficoll-Hypaque層上面。離心后，大部分淋巴細胞位于Ficoll-Hypaque和血漿之間的界面。材料與儀器肝素或枸櫞酸抗凝的血液樣本D-PBSAFicoll-Hypaque無血清培養(yǎng)液帶有鈍頭插管的注射器塑料Pasteur吸管或移液器血細胞計數器或電子細胞計數器離心機步驟1.用枸櫞酸或肝素抗凝容器采集血液標本（肝素或枸櫞酸抗凝的血液樣本，枸櫞酸或肝素的濃度依收集容器而定。透明的離心管或普通容器），然后

冷胰蛋白酶解離組織2022/12/16

原理剪碎的組織放在胰蛋白酶中于4°C放置16~18h，去除胰蛋白酶后溫育并于溫培養(yǎng)基中分散細胞。材料與儀器組織DBSS粗制胰蛋白酶生長培養(yǎng)基皮氏平皿培養(yǎng)瓶鑷子移液管錐形瓶剪刀冰浴步驟1.將組織（1~5g，預先稱重）移入加有新配制的無菌DBSS的皮氏培養(yǎng)皿中，清洗。2.轉入另一培養(yǎng)皿中，切除多余組織如脂肪和壞死組織。3.轉入第三個培養(yǎng)皿中，用交叉的手術刀細切成大約3mm3的小塊。胚胎的器官若小于3mm3，可全部保留。4.用彎鑷子將組織塊移入一個預稱重的15ml或50ml無菌離心管內。5.讓組織塊沉

膠原酶解離組織2022/12/16

原理切碎的組織放于含有膠原酶的完-全培養(yǎng)基中孵育，組織分解后，通過離心去除膠原酶，高濃度接種、培養(yǎng)。材料與儀器膠原酶DBSS培養(yǎng)基移液器皮氏平皿培養(yǎng)瓶離心管手術刀離心機步驟1.將組織移人新鮮、無菌的DBSS中，淸洗。2.轉入另一培養(yǎng)皿（9cm皮氏平皿，非組織培養(yǎng)級別），切除多余組織，如脂肪或壞死組織。3.將組織轉移至第三個平皿中，用交叉的手術刀細切成大約1mm3大小。4.用10~20ml廣口移液管將組織移入15ml或25ml無菌離心管或常用的容器，中（先用DBSS濕潤移液管，否則組織塊易貼壁）。

復蘇凍存細胞實驗2022/12/16

原理快速復蘇細胞，緩慢稀釋，以高細胞密度重新接種。材料與儀器步驟材料無菌培養(yǎng)瓶（如果需要離心時）生長培養(yǎng)基吸量管，1ml，10ml注射器和19號針頭（如果你使用玻璃凍存管）非滅菌保護性手套和面罩37℃無菌水，10cm深，盛于清潔、用乙醇擦拭過的帶蓋的水桶中鑷子70%乙醇棉簽1%萘黑（酰胺黑）或0.4%臺盼藍操作步驟1.檢查凍存目錄，確定將要復蘇的凍存管的位置2.收集所有材料，準備培養(yǎng)基，標記培養(yǎng)瓶3.從凍存罐中取出凍存管，檢查標簽，確定是否是所需要的凍存管，若小管未浸沒在液氮中，將小管放入塑料除

單層細胞的傳代2022/12/16

原理去除培養(yǎng)基，加人胰蛋白酶短暫作用，孵育，以培養(yǎng)基分散細胞，計數，稀釋并再接種。材料與儀器A549細胞WI-38MRC-5胰蛋白酶D-PBS70%乙醇噴壺生長培養(yǎng)基吸管離心管培養(yǎng)瓶移液器吸耳球吸水紙巾吸管桶抗乙醇記號筆血細胞計數板步驟1.準備超凈工作臺，將試劑及材料置于超凈臺，開始實驗。2.仔細檢査培養(yǎng)物有無污染或衰退跡象。3.依據標準和你對該培養(yǎng)物行為的了解，決定是否需要傳代（做練習13者應記錄細胞密度和狀態(tài)，如有絲分裂、多層、細胞變性）。若需要傳代，如下進行。4.將培養(yǎng)物置于無菌工作區(qū)域，

分離雞胚背根神經節(jié)2022/12/16

材料與儀器酶溶液DRG離心管培養(yǎng)皿解剖顯微鏡步驟解剖前在15ml離心管中配制酶溶液，置37℃水浴特用。2.解剖胚胎，解剖全過程保持組織濕潤。(1)殺死胚胎，去腿，放于100mm培養(yǎng)皿。(2)用鈍頭剪刀沿腹中線作一切口，將皮膚向兩側卷縮至能取出內臟。(3)CMF-PBS漂洗體腔。(4)用細鑷子或用CMF-PBS吹打，小心去掉脊柱上的任何黏附組織。3.在解剖顯微鏡下，用細鑷子從脊髓上細心撕下脊膜。取出交感神經節(jié)，即DRG上脊髓兩側的細條帶。4.用微簧剪刀從神經干上剪下神經節(jié)，用細鑷子從脊髓上摘下DR

分離培養(yǎng)細胞2022/12/16

原理骨豁肌源性成肌細胞能夠培養(yǎng)從幾種成年動物骨骼肌分離的成肌細胞。在培養(yǎng)條件下，成肌細胞仍繼續(xù)表達一些分化特征。成肌細胞稱衛(wèi)星細胞，分化早期的步驟與骨骼肌很相似。成肌細胞在培養(yǎng)底物上增殖和遷移，然后成直線排列，最終融合形成多細胞核肌管。在單肌纖維培養(yǎng)，按整塊取骨骼肌。用膠原蛋白液孵育，以消化結締組織。然后，輕微機械性研磨使肌纖維分離?？蓮墓趋兰》蛛x出肌纖維及其衛(wèi)星細胞。在添加20%（fetalbovineserum，FBS)的Ham'sF12培養(yǎng)中，原代細胞容易生長。在不改變培養(yǎng)條件的情況下，這

細胞培養(yǎng)如何選擇血清2022/12/16

體外培養(yǎng)的細胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基需要滿足細胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求；原代提取的時候選擇如何選擇培養(yǎng)基成了關鍵的問題，此外在細胞提取的時候因血清可以模擬個體的生存環(huán)境，在提取細胞的時候血清必-不可少。維持細胞生長的營養(yǎng)條件一般包括以下幾個方面：氨基酸，單糖，維生素，無機離子與微量元素，此外還有促生長激素，滲透壓，pH值，并保證在配制試劑的時候無毒無污染。正常的培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基無非是基礎培養(yǎng)基加血清。血清是一個神秘的試劑，至今為止，它在細胞的生長繁殖發(fā)

染色體制備2022/12/13

原理固定阻滯于分裂中期的細胞，在低滲液中膨脹，將細胞滴在載玻片上，染色，觀察[RothfelsａndSiminovitch，1958；RooneyａndCzepulkowski，1986]。材料與儀器D-PBS0.25%胰蛋白酶對數期的培養(yǎng)細胞秋水仙酰胺低滲溶液醋酸甲醇固定液Giemsa染液DPX或Permount封固劑冰離心管巴斯德吸管載玻片蓋玻片載玻片盒低速離心機渦流混懸器步驟1.將2×104~5×104個細胞/ml（4×103~1×104個細胞/cm2）20ml在75cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

染料攝取法測定細胞生存力實驗2022/12/13

原理細胞懸液用碘化丙啶和二乙酰熒光素的混合液染色，用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測。材料與儀器步驟材料無菌單細胞懸液雙醋酸熒光素，10ug/ml，溶于HBSS碘化丙啶，500ug/ml非滅菌熒光顯微鏡濾光片熒光素：激發(fā)450/590nm，發(fā)射LP515nm碘化丙啶：激發(fā)488nm，發(fā)射615nm操作步驟1.細胞懸液的制備與染料排斥法相同（見方案22.1)，但是生長液中不含酚紅。2.以1:10的比例加入熒光素染料混合液，二乙酰熒光素的終濃度為lug/ml，碘化丙啶的終濃度為50ug/ml。:3.將細胞

前列腺上皮2022/12/13

原理取出前列腺和處理標本（30min），用膠原蛋白酶消化前列腺組織（1h），收集單個細胞和小的細胞團（1h）。接種細胞，培養(yǎng)至形成單層（7d）。材料與儀器胎牛血清或馬血清青霉素卡那霉素霍亂毒索地塞米松EGF羊催乳激素或鼠催乳激素胰島素部分精制的前列腺調理素或精制的前列腺調理素I型膠原蛋白酶大鼠生長培養(yǎng)液鹽性培養(yǎng)液Petri培養(yǎng)皿手術剪注射器和14-G插管25mlErlenmeyer燒瓶金屬絲濾網50ml錐形塑料離心管尼龍濾網24孔塑料培養(yǎng)板振蕩水浴箱離心機血細胞計數板或Coulter計數器步驟在

瓊脂中克隆培養(yǎng)2022/12/13

原理溫度高時瓊脂呈液態(tài)，但在37℃時成凝膠狀態(tài)，細胞懸浮在溫暖的瓊脂凝膠培養(yǎng)基中，待瓊脂形成凝膠后進行培養(yǎng)，形成散在集落，很容易分離。材料與儀器Noble瓊脂Difco胎牛血清兩倍濃度培養(yǎng)基生長培養(yǎng)基無菌超純水無菌錐形瓶吸管通用容器培養(yǎng)皿水浴三角瓶托盤電子細胞計數儀本生煤氣噴燈步驟1.在培養(yǎng)皿底皿側面編號或做好標記，將培養(yǎng)皿放在托盤中，很方便。2.準備含40%FBS的2×培養(yǎng)基（即Ham’SF12、RPMI1640、DMEM或CMRL1066。用10×培養(yǎng)基配2×培養(yǎng)基，取半量所需終液量，加兩倍