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分離原代人角膜間質(zhì)細胞2022/12/09

原理材料與儀器完整的人角膜CMF-SaIineG中性蛋白酶IIL型膠原酶1mgml在DMEMF-12GASP中CMF-SaIineG配制的TrypLEExpress或0.25%膜蛋白酶DMEMF-12GASPDMEMF-122FBGASP:DMEMF-12GASP含2%FBSCMFGASP3.5cm塑料組織培養(yǎng)皿或6孔板手術(shù)刀或單刃的安全刀片細胞濾網(wǎng)70μm血液尼龍過濾網(wǎng)塑料刮片“CellLifter”或“CellScraper”彎虹膜剪11cm(4-38in.)Jeweler’s鑷10cm(4

平滑肌細胞的分離和培養(yǎng)2022/12/09

料與儀器0.25%胰蛋白酶和EDTA混合液平滑肌培養(yǎng)液Petri培養(yǎng)皿手術(shù)刀和10號手術(shù)刀片解剖剪組織鑷步驟1.從小牛取胸主動脈。2.將胸主動脈浸入Hanks液。3.分離細胞之前將動脈放在冰上。4.將動脈放入150mm×25mmPetri培養(yǎng)皿。5.用解剖剪沿長軸剪開動脈。6.用手術(shù)刀片輕刮動脈內(nèi)腔面，以除去內(nèi)皮細胞。7.將動脈的中膜與內(nèi)膜和外膜分離。8.將中膜切成約1cm2大小的組織塊。9.將中膜組織塊放入60mm×15mmPetri培養(yǎng)皿，內(nèi)膜側(cè)朝下。10.讓組織塊貼壁約10min。11.直

昆蟲細胞的擴增2022/12/07

原理用機械法從細胞單層分離細胞，在27°C條件下和懸浮狀態(tài)下進行擴增培養(yǎng)。材料與儀器Sf9細胞二甲基亞砜PluronicF68生長培養(yǎng)液培養(yǎng)瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶和磁力攪拌器27°C培養(yǎng)箱步驟常規(guī)維持培養(yǎng)1.通過刮取法或用培養(yǎng)液沖洗細胞（(ATCC#CRL-1711)或從甘藍環(huán)Trichoplusiani獲得的細胞系（Tn368或BTI-TN-5B1-4，也稱“HighFive”，可從Invitrogen購買））法使細胞從培養(yǎng)瓶中脫落，或者利用在旋轉(zhuǎn)瓶中懸浮生長的細胞。2.用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞，通過用臺

結(jié)腸直腸腫瘤細胞的培養(yǎng)2022/12/07

原理通常用酶消化腺瘤，用手術(shù)刀片將癌組織切碎。如果分化良好的結(jié)腸直腸癌標本切開后仍不易分離細胞，可用酶消化方法分離。材料與儀器用于傳代培養(yǎng)的Dispase生長培養(yǎng)液洗液消化液培養(yǎng)瓶步驟一、酶消化1.用洗液（洗液：添加5%FBS、200U/ml青霉素、200ug/ml鏈霉素和50ug/ml慶大霉素。在原代培養(yǎng)時，慶大霉素的作用至少維持一周，然后除去。）清洗腫瘤標本4次。2.將組織塊放入小量洗液中，洗液恰好浸沒組織塊（避免組織干）。用交叉的手術(shù)刀片或鋒利手術(shù)剪將組織塊剖成約1mm3小塊。3.通過用臺

口腔角質(zhì)形成細胞2022/12/07

材料與儀器D-PBSA0.17%胰蛋白酶PET轉(zhuǎn)運培養(yǎng)液生長培養(yǎng)液含抗菌素的生長培養(yǎng)液手術(shù)刀和11號刀片眼科剪眼科鑷2把50mm或100mm培養(yǎng)級Petri培養(yǎng)皿35mm和100mm非培養(yǎng)級Petri培養(yǎng)皿15ml錐形離心管微量加液器涂有FNCBSA的50mm培養(yǎng)皿步驟一、原代培養(yǎng)1.取手術(shù)切除或早期活檢組織，將組織放入轉(zhuǎn)運培養(yǎng)液（LeibowitzL-15培養(yǎng)液，添加100μg/ml慶大霉素、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和1μg/ml2性霉素B），盡快送到實驗室。2.將組織移入

角膜上皮細胞培養(yǎng)實驗2022/12/07

原理將角膜組織置于膠原蛋白上，使其附著。然后，在涂有纖連蛋白和膠原蛋白的培養(yǎng)皿擴增培養(yǎng)。材料與儀器D-PBSA無血清角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)液胰蛋白酶EDTABiocoat6孔培養(yǎng)板步驟一、材料滅菌無血清角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)液（keratinocyteserum-freemedium，KGM;Clonetics):含有0.15mmol/LCa2-、0.1ng/ml人上皮生長因子、5ug/ml胰島素、0.5ug/ml氫化可-的松和30ug/ml牛垂體提取物。EMEM(Eagle'sminimalessenti

過濾裝置的滅菌2022/12/06

材料與儀器過濾器外殼架子預(yù)過濾器玻璃纖維尼龍袋高壓滅菌無菌指示膠帶消毒鍋步驟1.用清潔劑完-全淸洗后，用水沖洗過濾裝置，然后用去離子水沖洗，并晾干。2.在過濾器中插入濾板，然后將過濾膜放到濾板上，如果過濾膜是由多聚碳酸鹽制成的，要弄濕以消除靜電。3.將預(yù)過濾器（玻璃纖維和其他需要的物質(zhì)）放在過濾器的頂端。4.安裝過濾器支架，不要完-全擰緊（可以留一個螺圈）。5.過濾器的進口與出口均用鋁箔封住。6.用消毒紙或蒸汽可滲透的尼龍膜將過濾裝置包好，貼上無菌指示膠帶。7.在121°C，100kPa(1ba

放射自顯影術(shù)實驗2022/12/06

簡介培養(yǎng)細胞的放射自顯影術(shù)射性既可以研究細胞本身的物質(zhì)代謝之外，還可用來分析細胞的動態(tài)活動、細胞周期等。原理培養(yǎng)細胞放射自顯影術(shù)原理是將培養(yǎng)細胞的放射性同位素釋放射線，作用于感光乳膠，使感光乳膠中的鹵化銀感光形成潛影，再經(jīng)顯影劑作用，感光的鹵化銀還原成黑色的銀顆粒，未感光的銀鹽則經(jīng)定影去除，在乳膠中留下清楚明確的圖像。材料與儀器器材：①培養(yǎng)的細胞②細胞傳代培養(yǎng)的設(shè)備③直徑3.5cm塑料培養(yǎng)皿（或50ml培養(yǎng)瓶）④2.2cmx2.2cm蓋片（或自裁成6mmx40mm，放入培養(yǎng)瓶）⑤曝光鉛盒或黑色塑

脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)染2022/12/06

材料與儀器L8057-Y10細胞D-PBSA培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板F12FB培養(yǎng)基G418(Invitrogen)選擇性培養(yǎng)基電穿孔電穿孔專用杯電穿孔儀II電穿孔儀-II配套的效能擴增器-Plus步驟表達載體與DNA制備：pSVTKGH，線性化[Seldenetal.，1986]此載體含有SV40增強子及單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子序列，兩者可啟動人類生K激素（hGH)基因表達。hGH可直接分泌到組織培養(yǎng)基上，可通過放射免疫學(xué)分析法直接檢測[Ravidetal.，1991]。pcDNA3，線性化（Invit

非肌肉肌動蛋白的純化2022/12/06

材料與儀器非肌肉肌動蛋白DNA酶Ⅰ緩沖液DEAE柱步驟1.準備貯存液和材料。2xDNA酶Ⅰ緩沖液：20mmol/LTris-HCl，pH8.01mmol/LDTT0.4mmol/LCaCI20.4mmol/LATP抑蛋白酶肽抑蛋白酶亮抑蛋白酶肽抑胃酶肽APMSFTPCK50%甲醛在DNA酶柱緩沖液中0.4mol/LNH4CI在DNA酶Ⅰ緩沖液中0.3mol/LKCl在DNA酶Ⅰ緩沖液中DNA酶Ⅰ柱緩沖液2.準備一個5~10ml的DNA酶Ⅰ的親和柱。3.準備一個0.2~1ml的DEAE柱：用DNA

倒置顯微鏡的使用2022/12/05

原理將培養(yǎng)物放在顯微鏡的載物臺上，打開電源，選擇合適的鏡頭，聚焦于標本。如果必要的話，將聚光器和相差環(huán)調(diào)節(jié)在中心。材料與儀器倒置顯微鏡擦鏡紙步驟確保顯微鏡（配有相差10×、20×或40×的物鏡及聚光器和合適的相差環(huán)）潔凈（用70%乙醇擦拭載物臺。如果有必要，用擦鏡紙清潔物鏡）。2.打開電源，將燈光強度從最-低開始調(diào)至合適的強度，而不是直接打到強光。3.檢查光源與聚光器的銜接：(a)將一張染色切片、培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿放在載物臺上；(b)關(guān)閉視場光圈；(c)聚焦在可變光闌上；(d)將可變光闌成像調(diào)整到視

大鼠肝細胞分離實驗2022/12/05

原理經(jīng)肝門靜脈或肝門靜脈分支插管，用無鈣緩沖液灌洗肝15min，再用酶溶液灌洗15min。收集和洗滌細胞，計數(shù)有活力的肝細胞。材料與儀器L-15Leibovitz培養(yǎng)液HamF12培養(yǎng)液胞培養(yǎng)液HMMSF無鈣HEPES緩沖液膠原蛋白酶液5%戊芭比妥鈉肝素聚乙稀管一次性20G頭皮靜脈輸液針縫合線l注射器水浴箱蝠動泵步驟一、材料1.無菌（1）L-15Leibovitz培養(yǎng)液（2）HamF12培養(yǎng)液或WilliamE培養(yǎng)液：80～100ml，含有0.2%牛白蛋白（V級，Sigma)和1ug/ml牛胰島

蛋白質(zhì)合成實驗2022/12/05

材料與儀器步驟材料無菌細胞培養(yǎng)，如1X104～1X106個細胞，24孔板3H-亮氨酸。無血淸培養(yǎng)基中2MBq/ml(～50uCi/ml)(特異活性并不重要，因為它將由培養(yǎng)基中的亮氨酸濃度決定）非無菌SLS或SDS，1%(35mmol/L)溶于0.3mol/LNaOH三氯醋酸（TCA)液閃瓶Eppendorf管閃爍液，最小含水為10%操作步驟1.細胞生長至所需密度。2.從孵箱中取出培養(yǎng)板，加人預(yù)溫的溶于培養(yǎng)液或BSS中的放射性同位素，稀釋度為1:10(如l00ul/ml/孔）。3.盡快地將細胞放回

分離ARVM細胞2022/12/05

材料與儀器鼠KH緩沖液混合氣體對流工作臺或?qū)恿魇匠瑑襞_乙酉迷罩冷凝器循環(huán)水浴和水浴搖床圈型架蠕動泵臺式醫(yī)用離心機無菌燒杯ColorpHastpH試紙步驟一、ARVM細胞分離的準備工作1.準備如下設(shè)備及器材：對流工作臺或?qū)恿魇匠瑑襞_乙酉迷罩冷凝器循環(huán)水浴和水浴搖床帶夾的圈型架免蠕動泵臺式醫(yī)用離心機95%O25%CO2混合氣體400ml無菌燒杯ColorpHastpH試紙（精密型）2.在對流式或?qū)恿魇焦ぷ髋_中，裝配Langedorff系統(tǒng)，把冷凝器和三通管夾著固定在圈型架上，管子接上蠕動泵。冷凝器連

多潛能干細胞的誘導(dǎo)2022/12/02

簡介多潛能干細胞（in-ducedpluripotentstemcells，iPS）技術(shù)不僅可以解決胚胎干細胞來源引起的倫理問題，而且自體iPS細胞可以避免異體來源胚胎干細胞移植引起的免疫排斥反應(yīng)。目前就成體細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細胞相關(guān)的幾種轉(zhuǎn)錄因子以及誘導(dǎo)方法、如何提高誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細胞的效率以及iPS細胞臨床應(yīng)用方面都是在Yamanaka報道的誘導(dǎo)方案基礎(chǔ)上的改良。原理Yamanaka法誘導(dǎo)多能干細胞的原理是把Oct3/4，Sox2、c-Myc和Klf4這四種轉(zhuǎn)錄因子基因克隆入病毒載體，然后引

E玫瑰花環(huán)形成試驗2022/12/02

原理正常人外周血中T細胞在體外能直接和綿羊紅細胞（SRBC）結(jié)合形成玫瑰花樣細胞團。這是因為人的T細胞膜上具有能和SRBC膜上的糖蛋白相結(jié)合的受體，稱為E受體。已證實E受體是人T細胞所*的表面標志，因此本試驗可作為人外周血T細胞的鑒定和計數(shù)，同時作為人細胞免疫功能狀態(tài)的一個檢測指標，也是分離T細胞的常用方法之一。本實驗為示教內(nèi)容，學(xué)生只看結(jié)果。材料與儀器肝素抗凝人外周血淋巴細胞分層液SRBC懸液Hank's液NBS血球計數(shù)板尖吸管載玻片瑞氏染液步驟1.取肝素抗凝血1ml加1mlHank's液，混

大鼠肝癌模型法2022/12/02

原理1.Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條在生物進化中極為保守的通路。在正常的體細胞中，β-catenin只是作為一種細胞骨架蛋白在胞膜處與E-cadherin形成復(fù)合體對維持同型細胞的黏附、防止細胞的移動發(fā)揮作用。只有當細胞外Wnt信號分子與細胞膜上特異性受體Frizzled蛋白結(jié)合激活胞內(nèi)的dishevelled（散亂的）蛋白導(dǎo)致GSK3B失活，使α-catenin避免被磷酸化而遭降解的命運,β-catenin才能在胞質(zhì)中積累起來。2.當胞質(zhì)中B-catenin的濃度達到一定水平時

端粒顯示實驗2022/12/01

簡介端粒（telomere）是真核細胞染色體末端的DNA重復(fù)序列，它與多種端粒結(jié)合蛋白結(jié)合在一起，發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，在細胞分裂的過程中，盡管端粒也會不斷的縮短，但可以通過端粒酶的催化，以自身RNA為模板進行補充，從而代償了這一損失。端粒的功能保護染色體末端完整性，穩(wěn)定染色體，保障染色體DNA在復(fù)制的過程中不被縮短，保護染色體結(jié)構(gòu)基因，防止基因組DNA降解、防止染色體末端融合，調(diào)節(jié)細胞生長、衰老等作用。目前，用于端粒顯示實驗的方法主要有3種：Southern印跡法、Q-FISH法和qPCR法。

蛋白質(zhì)分離實驗2022/12/01

簡介蛋白質(zhì)分離的方法主要有3種：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)、免疫沉淀法分離蛋白質(zhì)和雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)。原理SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)的基本原理是蛋白質(zhì)在SDS和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵打開，形成帶負電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，聚丙烯酰胺（PAGE）是一種具有三維結(jié)構(gòu)的網(wǎng)狀高分子聚合物，具有分子篩的作用。蛋白質(zhì)在PAGE電泳中向正極遷移，遷移速率取決于分子的大小、電荷及其空間結(jié)構(gòu)。SDS帶有較強的負電荷，不同的蛋白質(zhì)與之結(jié)合后具有相同的荷質(zhì)比，

EB病毒轉(zhuǎn)化成淋巴細胞2022/12/01

材料與儀器全血刀豆凝集素ARPMI生長培養(yǎng)基離心管步驟混合10ml全血和10mlRPMI生長培養(yǎng)基。生長培養(yǎng)基（RPMI1640800ml，F(xiàn)BS200ml，2mmol/L-谷氨酰胺，5μg/ml兩性霉素，50μg/ml慶大霉素）2.取15ml無菌離心管，加3mlHisto-paque1077（Sigma），在其上加4ml稀釋血，分離淋巴細胞。3.室溫300g離心30分鐘，棄上層清亮血漿。4.收集不透明淋巴細胞層，細胞懸液倒入50ml無菌離心管。5.20mlRPMI1640生長培養(yǎng)基洗兩次，室溫