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miRNA 成熟過(guò)程中的關(guān)鍵性酶和蛋白2023/06/27: RNApolymeraseII：一般認(rèn)為miRNA基因由RNApolymeraseII轉(zhuǎn)錄而來(lái)?？蓪iRNA基因轉(zhuǎn)錄成5'端蓋帽m7G和3‘端加尾polyA結(jié)構(gòu)。Drosha：Drosha蛋白為RNaseIIIenzyme家族中的成員之一，主要作用就是剪切Pri-miRNA成為具有3‘端2nt懸垂的pre-miRNA。DGCR8：是第一個(gè)被鑒定出來(lái)的參與了體內(nèi)miRNA加工過(guò)程的Pasha蛋白，參與了Drosha蛋白對(duì)底物的識(shí)別。Exportin5：為核轉(zhuǎn)運(yùn)受體家族的一個(gè)成員，其作用過(guò)程通過(guò)核

lncRNA 的生物學(xué)功能（二）2023/06/27: 一）lncRNA對(duì)于細(xì)胞周期及凋亡的調(diào)控作用有研究報(bào)道，lncRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡的方式，來(lái)影響細(xì)胞的增殖。例如，Gas5（growtharrest-specific5，非編碼RNA）在細(xì)胞周期阻滯的細(xì)胞內(nèi)大量集聚。其發(fā)揮作用的機(jī)制是抑制對(duì)于糖皮質(zhì)激素敏感的基因表達(dá)，使得細(xì)胞發(fā)生凋亡。Gas5能與糖皮質(zhì)激素受體上的“糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件”（glucocorticoidresponseelement，GRE，該反應(yīng)元件位于糖皮質(zhì)激素受體的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)）相結(jié)合，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制的方式抑

lncRNA 的生物學(xué)功能（一）2023/05/17: （一）lncRNA對(duì)于細(xì)胞周期及凋亡的調(diào)控作用有研究報(bào)道，lncRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡的方式，來(lái)影響細(xì)胞的增殖。例如，Gas5（growtharrest-specific5，非編碼RNA）在細(xì)胞周期阻滯的細(xì)胞內(nèi)大量集聚。其發(fā)揮作用的機(jī)制是抑制對(duì)于糖皮質(zhì)激素敏感的基因表達(dá)，使得細(xì)胞發(fā)生凋亡。Gas5能與糖皮質(zhì)激素受體上的“糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件”（glucocorticoidresponseelement，GRE，該反應(yīng)元件位于糖皮質(zhì)激素受體的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)）相結(jié)合，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制的方式

構(gòu)建載體2023/05/05: 構(gòu)建載體最關(guān)鍵的一步就是設(shè)計(jì)引物引入酶切位點(diǎn)，一旦引物設(shè)計(jì)好，那接下來(lái)就非常簡(jiǎn)單了，今天重點(diǎn)就來(lái)教教大家如何利用snapgene輕松獲得構(gòu)建載體所需的引物序列。1.打開(kāi)軟件，選擇第一個(gè)（紅線(xiàn)標(biāo)記），然后輸入基因的CCDS序列（基因的CCDS序列可在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得）。2.點(diǎn)擊ok后界面，圖中顯示的是會(huì)切割基因編碼序列的酶3.接下來(lái)點(diǎn)擊最上面的EnzymesNoncutters，會(huì)顯示所有不會(huì)切割基因編碼序列的酶，這些酶都是我們可以用的，選酶的標(biāo)準(zhǔn)：要選擇不能切割目的基因序列并且質(zhì)粒上含有的酶

引物設(shè)計(jì)原則2023/05/05: 1）擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度100bp-150bp為佳；2）引物長(zhǎng)度17bp-25bp最好；3）正向引物和反向引物的Tm值最好相差不要超過(guò)1℃。Tm值調(diào)整至60℃-65℃為佳；4）引物的GC含量控制在40%-60%之間，最佳為45%-55%；5）引物3'末端堿基最好為G或C或A，避免使用T；6）避開(kāi)引物內(nèi)部或者兩條引物之間有3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列，二條引物之間的3'端避開(kāi)有2個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列；7）引物A、G、C、T整體分布盡量要均勻，避免使用GC或者TA含量高的區(qū)域，尤其是3'端，必須避開(kāi)GC含量不均勻

PCR 操作中必知的 6 大細(xì)節(jié)2023/05/05: 1、最好使用一次性進(jìn)口tip頭，以避免液體殘留；同時(shí)，tip頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。2、加樣時(shí)，tip頭要伸入PCR反應(yīng)管的液面下一點(diǎn)，然后將液體緩緩打入液面下，至恰好打出一個(gè)小氣泡為至；加樣過(guò)程最好在冰塊上操作；移液槍用完之后要?dú)w到最大計(jì)量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性，而導(dǎo)致加樣量的不準(zhǔn)確。3、配制反應(yīng)體系時(shí)，若反應(yīng)物為凍結(jié)制品，需在融解后上下顛倒輕輕均勻混合；加入試劑之前，把它混勻一下，以免放置時(shí)間長(zhǎng)了濃度不均；按照液體體積由大到小的順序?qū)⒎磻?yīng)物加入到PCR管中；引物

PCR 引物設(shè)計(jì)2023/05/05: 好的引物會(huì)讓PCR實(shí)驗(yàn)成功一半，因而，引物設(shè)計(jì)一直都是PCR非常重要的環(huán)節(jié)。經(jīng)典之法就是讓Premier5攜手oligo，共同設(shè)計(jì)PCR引物。1、以小鼠的IL-17為例，進(jìn)入NCBI界面,選擇Nucleotide后，輸入IL-17，點(diǎn)擊search。然后選擇人類(lèi)IL-17的mRNA，在CDS選項(xiàng)中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，選定目的序列。2、打開(kāi)PrimerPremier5軟件，點(diǎn)擊菜單欄File|New|DNASequence，在出現(xiàn)的對(duì)話(huà)框里黏貼目的序列，并在paste對(duì)話(huà)

PCR 產(chǎn)物純化2023/04/21: 材料與儀器TE或去離子水PCR產(chǎn)物離心機(jī)和轉(zhuǎn)子PCR濾件微量離心管步驟一、材料1.緩沖液和溶液TE(lOmmol/LTris-HCl，lmmol/LEDTA，pH7.5)或去離子水2.核酸和寡核苷酸待測(cè)序的PCR產(chǎn)物3.離心機(jī)和轉(zhuǎn)子帶有固定傾角轉(zhuǎn)子的小型離心機(jī)，如Eppemlorf5415C4.特殊設(shè)備AmiconMicrocon-PCR濾件（Millipore)或者相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品，微董離心管或接收管二、方法1.對(duì)每一個(gè)待純化的PCR產(chǎn)物，都在接收管中放置一個(gè)濾件，濾件的儲(chǔ)液面向上儲(chǔ)液池中加入400

DNA 污染的柱上去除2023/04/21: 材料與儀器DNA酶I緩沖液DNA酶I細(xì)胞裂解液步驟一、材料1.酶和酶緩沖液DNA酶I，擴(kuò)增級(jí)（無(wú)RNA酶）DNA酶I緩沖液，10X2.細(xì)胞和組織利用總RNA純化試劑盒（例如Madigen總RNA快速純化系統(tǒng)）獲得的細(xì)胞裂解液。二、方法1.將裂解液上到總RNA純化試劑盒（例如Marligen總RNA快速純化系統(tǒng)）所帶的離心套柱上。2.將裂解液上到RNA純化膜上之后，將50ul含5UDNA酶I、在1XDNA酶I緩沖液中的DNA酶I溶液加到每個(gè)離心套柱中。3.室溫下溫育15min。4.于方案6中二、方

冷凍組織及切片的準(zhǔn)備2023/04/21: 材料與儀器1、新鮮的組織2、丙酮蒸餾水干冰磷酸鹽緩沖液（PBS)TekOCT組織復(fù)合物3、封閉容器燒杯恒冷裝置解剖工具平盤(pán)組織模子載玻片刀片步驟一、材料1.緩沖液、溶液和試劑丙酮蒸餾水干冰磷酸鹽緩沖液（PBS)TekOCT組織復(fù)合物（SakuraFinetekUSA，Torrance，CA)2.特殊設(shè)備封閉容器燒杯恒冷裝置解剖工具平盤(pán)可以削去的一次性組織模子（PelcoInternational，Redding，CA)普通的無(wú)粘片劑的載玻片Sakura刀片（IMEB，SanMarcos，CA)3

單鏈 cDNA 的合成2023/04/21: 材料與儀器步驟一、材料1.緩沖液、溶液和試劑去除RNA酶的雙蒸水10XRT-PCR緩沖液（去除RNA酶的雙蒸水，100mmol/LTris-HCl、pH8.3，500mmol/LKC1,15mmol/LMgCl2)2.酶和酶緩沖液MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（100~200U/ul)SUPERaseINRNA酶抑制劑（20U/ul;Ambion)3.核酸和寡核苷酸dNTP混合物（10mmol/L，包含所有四種dNTP)隨機(jī)引物（5umol/L)總RNA(達(dá)到2.5ug)4.實(shí)驗(yàn)器材薄壁的PCR管二、方法1.

從有限的細(xì)胞中提取 RNA2023/04/21: 材料與儀器LCM帽子乙醇糖原RNA提取試劑盒超純水移液器步驟一、材料1.緩沖液、試劑和溶液75%乙醇(超純水配制）糖原，5mg/ml(Ambion，Austin，TX)StratageneRNA提取試劑盒（200345，StratageneCloningSystems，LaJolla,CA)，包括變性溶液、飽和酚(存于4°C)、β-巰基乙醇(存于4°C)、氯仿：異戊醇、2mol/L乙酸鈉、異丙醇?；蛘呤褂肞icoPureRNA分離試劑盒（KIT0202，Arcturus，MountainView

細(xì)胞融合的方法及誘導(dǎo)物2023/04/19: 同種細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)2個(gè)靠在一起的細(xì)胞自發(fā)合并，稱(chēng)自發(fā)融合;異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合，稱(chēng)誘發(fā)融合。仙臺(tái)病毒法融合①兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4℃條件下病毒附著在細(xì)胞膜上。并使兩細(xì)胞相互凝聚;②在37℃中，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)，細(xì)胞膜受到破環(huán)，此時(shí)需要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2;②細(xì)胞膜連接部穿通，周邊連接部修復(fù)，此時(shí)需Ca2+和ATP;④融合成巨大細(xì)胞，仍需ATP。聚乙二醇(PEG)法聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C(CH20CH2)nCH2OH，分子量大于2

大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取2023/04/19: 實(shí)驗(yàn)方法原理堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線(xiàn)性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們。在堿性pH環(huán)境，DNA變性，當(dāng)恢復(fù)中性并在高鹽離子濃度時(shí)，絕大多數(shù)質(zhì)粒DNA可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中；而線(xiàn)性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，相互交聯(lián)纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上與蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。離心后獲得大量質(zhì)粒的上清液，利用親水性有機(jī)溶劑（乙醇、異丙醇、PEG8000）使質(zhì)粒DNA脫水，離心后收集。實(shí)驗(yàn)材料含質(zhì)粒的大腸桿菌試劑、試劑盒葡萄糖EDTATris-HClNaOHSDSKAc異戊醇儀器、耗材臺(tái)式高速離心機(jī)恒溫振蕩

蛋白酶活性檢測(cè)方法2023/04/19: 1定義1g固體酶粉(或1mL液體酶)，在一定溫度和PH值條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1ug酪氨酸為一個(gè)酶活力單位，以(u/mL)表示。2福林法(第一法)2、1原理蛋白酶在一琿的溫度與PH條件下，水解底物，產(chǎn)生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等)，在堿性條件下，將福林試劑(Folin)還原，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，用分光度法測(cè)定，計(jì)算其酶活力。2、2試劑和溶液2、2、1福林試劑的制備于2000mL磨口回流裝置中加入鎢酸鈉(Na2Wo4·2H2O)100g、鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25g、水7

植物蛋白質(zhì)組學(xué)和糖基化2023/04/19: 1.前言與其他真核細(xì)胞一樣，植物細(xì)胞中，糖基化通常發(fā)生在分泌蛋白質(zhì)上，雖然在細(xì)胞質(zhì)蛋白和核蛋白上也發(fā)現(xiàn)一些糖基化反應(yīng)。根據(jù)寡糖部分和蛋白質(zhì)骨架之間的連接方式，可將糖基化分為兩種類(lèi)型：N-糖基化和O-糖基化。植物中N-糖基化研究最多。1.1N-糖基化與其他真核細(xì)胞一樣，在植物細(xì)胞中，N-糖基化只發(fā)生在進(jìn)入分泌途徑的蛋白質(zhì)上。它從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的寡聚糖前體Glc3Man9GlcNAC2共翻譯轉(zhuǎn)移到構(gòu)成初生蛋白質(zhì)(Asn-X-Ser/Thr，X可以是除脯氨酸和天冬氨酸以外的任意一種氨基酸）N--糖基化序列的

標(biāo)記抗體的應(yīng)用技術(shù)2023/04/12: 原理ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。即：用于檢測(cè)抗體的間接法、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。材料與儀器B

B 淋巴細(xì)胞膜表面免疫球蛋白的檢查2023/04/12: 原理SmIg是B細(xì)胞的抗原識(shí)別受體，也是B細(xì)胞特異的表面標(biāo)志，用直接免疫熒光法可檢查出SmIg。用熒光素標(biāo)記的抗Ig抗體，在一定條件下與淋巴細(xì)胞混合，熒光素標(biāo)記的抗Ig抗體可以與B細(xì)胞表面的Ig結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀(guān)察可見(jiàn)B細(xì)胞膜上出現(xiàn)熒光。此方法可用來(lái)鑒定B淋巴細(xì)胞。材料與儀器ICR小鼠異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的兔抗小鼠Ig抗體Hank's液臺(tái)式離心機(jī)離心管吸管移液管步驟1.采用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖取出脾臟放入盛有6mlHank's液的平皿中，用100目鋼網(wǎng)研磨，混勻。從中吸取1ml

兔多克隆抗血清的制備2023/04/12: 材料與儀器抗原PBS乙醇注射針頭注射器培養(yǎng)箱步驟1.取2ml的弗氏完-全佐劑加到2ml的溶于PBS的純化抗原中，使之乳化。用3ml注射器抽取此乳化液，接上22G注射針頭，排出注射器中的氣泡。2.將兔子敢在固定架上，用一只手抓住兔的頸背部毛皮，另一只手托住兔的后腿及臀部，將兔束緊固定以使后肢不能伸張，用70%乙醇對(duì)所要注射的區(qū)域進(jìn)行清潔消毒，在后肢大腿肌肉內(nèi)進(jìn)針約1cm深，毎條大腿肌肉內(nèi)最多注射0.5ml乳化液。3.四周后，用1mg的混溶干弗氏不完-全佐劑的抗原乳化液（1：1）對(duì)兔進(jìn)行肌肉內(nèi)加強(qiáng)免

怎么培養(yǎng)好你的細(xì)胞2023/04/11: 細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞和分子生物學(xué)的主要工具之一，提供研究細(xì)胞正常生理學(xué)和生物化學(xué)的優(yōu)秀模型系統(tǒng)（例如，代謝研究、衰老）、藥物和有毒化合物對(duì)細(xì)胞的影響，突變和致癌。它還用于藥物篩選和開(kāi)發(fā)，以及大規(guī)模生產(chǎn)生物化合物（如疫苗、治療性藥物）蛋白質(zhì)）。在這些應(yīng)用中使用細(xì)胞培養(yǎng)的主要優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)使用一批試驗(yàn)獲得的結(jié)果的一致性和再現(xiàn)性克隆細(xì)胞。培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)最重要的組成部分，因?yàn)樗鼮榧?xì)胞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子和激素，以及調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH值和滲透壓。雖然最初的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)是使用從組織提取物和體液中獲得的天然培養(yǎng)

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